بروتوكول لكشف ونبش النفايات الغاز مرحلة الجذور الحرة في دخان السجائر العادي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس كمية الجذور الحرة في دخان التبغ الرئيسي وتقييم القدرة الكاسحة لعدة مضادات أكسدة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير مرشحات تحتوي على عدة مركبات كاسحة مختلفة بالإضافة إلى ضوابط بدون مرشح كاسح. ويلي عملية التحضير محاكاة للتدخين باستخدام دخان سجائر بحثية، يمر عبر محلول اصطياد دوراني.

يُستخدم بعد ذلك رنين دوران الإلكترون، والذي يُرمز له اختصاراً بـ ESR، لتسجيل أطياف الجذور الحرة المحتجزة وكذلك العينات المرجعية. بعد ذلك، تخضع أطياف ESR التي تم الحصول عليها لتحليل روتيني من أجل فصل إشارة جذور المرحلة الغازية المحتجزة عن الخلفية، وتحديد تركيز الجذور الحرة كمياً باستخدام عينة مرجعية. وفي النهاية، تظهر النتائج معلومات كمية عن محتوى الجذور الحرة في الدخان الرئيسي للسجائر وتقديرات لقدرة الكنس للمضادات الأكسدة الطبيعية من خلال مطيافية ESR لاحتجاز الدوران.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لتحليل دخان التبغ، مثل كروماتوغرافيا الغاز، في أن ESR حساس بشكل خاص للجذور الحرة. ويمكن أن تساعد تداعيات هذه التقنية في الحد من الآثار الخطرة لدخان التبغ لأن الجذور الحرة تمثل مجموعة رئيسية من المسرطنات. كما يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية معمقة في دراسة الجذور الحرة في دخان السجائر، ويمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل عوادم الدخان الصناعي والتدخين. ويعد المركز الوطني للبحوث الطبية الحيوية لتقنية رنين دوران الإلكترون، المعروف أيضاً باسم cert، نتاجاً لخبرتنا الواسعة في تطوير تقنية ESR الحديثة.

للباحثين العاملين في مجال الرنين المغناطيسي الإلكتروني، نقدم مجموعة واسعة من الخدمات لهم وللمجتمع الطبي الحيوي. نحن نتيح مرافقنا بانتظام لدمج مضادات الأكسدة في مرشح السجائر. أولاً، قم بإذابة مضادات الأكسدة، والبيكنوجينول، ومستخلص العنب في 95%ethanol، ثم أذب الليكوبين في الأسيتون.

قم بتعديل أحجام المذيبات بناءً على ذوبانية مضادات الأكسدة. بعد ذلك، اخلط مضادات الأكسدة المذابة مع الكربون المنشط عن طريق التقليب في ظروف لاهوائية لمدة 12 ساعة تقريبًا. ويتم تحقيق الظروف اللاهوائية عن طريق تمرير فقاعات من غاز Argonne عبر الخليط أثناء التقليب.

بعد الانتهاء من الحضن، قم بترشيح المحلول وتجفيفه تحت التفريغ. بعد ذلك، أدخل مضادات الأكسدة والكربون في مرشح أسيتات تقليدي عن طريق قطع المرشح أولاً إلى قطعتين. ضع مضادات الأكسدة النباتية المغلفة بين قطعتي المرشح لتكوين شطيرة من مرشح مضادات الأكسدة، ثم أعد إدخالها في أسطوانة ورق السجائر.

قم بتجهيز الفلتر الضابط بنفس طريقة تجهيز الفلتر المضاد للأكسدة، باستثناء عدم إضافة المادة المضادة للأكسدة قبل الإعداد التجريبي. يجب تفريغ سجائر البحث وحفظها في بيئة ذات رطوبة ثابتة باستخدام محلول بروميد الصوديوم المشبع لمدة يومين على الأقل. استخرج أعواد السجائر التي تحتوي على التبغ وقم بتثبيتها بالفلتر المدمج.

قم بإجراء محاكاة التدخين للتحليل الروتيني في درجة الحرارة المحيطة باستخدام جهاز تدخين أحادي المنفذ، والذي يتكون من شفاط مائي أو مضخة تفريغ/ضاغط هواء متصل بمجموعة الاصطياد الدوراني عبر وصلة على شكل حرف T ذات طرف واحد مفتوح. استخدم مقياس تدفق للتحقق من تدفق الغاز وضبطه عند 2.2 قدم مكعب قياسي في الساعة تقريباً عن طريق تعديل صمام موضوع بين المضخة ومنفذ التهوية. قم بتدخين سجائر البحث باستخدام حجم نفخة مكثفة يبلغ 35 milliliters لمدة ثانيتين، وكرر العملية كل 60 ثانية.

يجب سد الطرف المفتوح لجهاز التدخين لإجراء السحبات وتركه مفتوحاً بين السحبات. وبينما يكون الطرف غير مسدود، يكون سحب الهواء عبر السيجارة ضئيلاً، وهو ما يتوافق مع الظروف السائدة بين السحبات. يتم أخذ 10 سحبات قوية لكل سيجارة لجمع الجذور الحرة في الطور الغازي عن طريق تمرير الدخان الرئيسي للسيجارة عبر وسادة مرشح كامبريدج (Cambridge filter pad)، ثم إدخاله في محلول مصيدة الغزل (spin trapping solution).

تعمل مصيدة النيتروجين السائل على إزالة بخار الماء من تيار الدخان الرئيسي، ولكنها لا تؤثر بشكل جوهري على الجذور الحرة في الطور الغازي. بعد النفخة الأخيرة، انقل جزءاً من محلول الاحتجاز الذي تمت فقاعته إلى أنبوب عينة زجاجي يبلغ طوله حوالي 10 بوصات وقطره الداخلي 3 ملم. وبما أن الأكسجين يؤدي إلى تعريض أطياف ESR وتقليل حساسية الطريقة، قم بإزالة الأكسجين من المحلول باستخدام طريقة التجميد والضخ والإذابة، وذلك عن طريق غمس الأنبوب أولاً في النيتروجين السائل، ثم تفريغ المحلول باستخدام مضخة زيت، ثم إذابة المحلول تحت غاز Argonne.

كرر طريقة التجميد والضخ والإذابة هذه عدة مرات. بعد ذلك، أغلق الأنبوب تحت تفريغ هوائي. أصبح الأنبوب الآن جاهزاً.

لإجراء قياسات إضافية بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (ESR)، قم بتسجيل أطياف ESR بنطاق X على مقياس طيف Bruker EMX بتردد 9.34 gigahertz. وفي الظروف القياسية، راجع البروتوكول المكتوب لمعرفة إعدادات مقياس الطيف النموذجية المستخدمة. وبالنسبة لهذه التجارب، قم بإجراء 25 تجميعاً لـ ESR، وهو ما يستغرق عادةً حوالي 20 دقيقة.

على الرغم من أن مقتنصات الغزل (spin trap adducts) مستقرة نسبيًا في الظروف التجريبية بعد مرور 12 ساعة، إلا أن شدة إشارات ESR في محلول البنزين انخفضت بمعامل قدره خمسة. ولتقدير تركيز مقتنص الغزل كمياً، قم بتكامل طيف ESR للمشتقة الأولى الأولي. ويظهر طيف الامتصاص الناتج خلفية أحادية عريضة، يُرجح أن تكون ناتجة عن منتجات السخام والقطران الموجودة في الدخان.

بعد طرح هذه الخلفية، قم بدمج الثلاثية المنفصلة للـ trapping adduct. مرة أخرى للحصول على تركيز الجذور الحرة. تُقارن قيم التكاملات المزدوجة لمحلول spin trapping مع تلك الخاصة بمحلول من nitrox radical tempo ذو تركيز معروف من التجربة الموضحة هنا، بالإضافة إلى حسابات إضافية موجودة في البروتوكول المكتوب.

تم الحصول على تركيز للجذور الحرة في الطور الغازي لدخان السجائر الرئيسي يبلغ حوالي 7.1 × 10⁻⁹ مولار. وبناءً على ذلك، تبيّن أن العدد الإجمالي للجذور المحتجزة من الطور الغازي لسيجارة كاملة يبلغ حوالي 1.5 × 10¹⁵. وخلال هذه التجربة، أدت القياسات الأولية إلى ظهور إشارات ESR ضعيفة وانخفاض في إمكانية تكرار النتائج بسبب وجود الرطوبة في تدفق الدخان.

ولحل هذه المشكلة، تمت إضافة مصيدة نيتروجين سائل إلى جهاز محاكاة التدخين بين مرشح كامبريدج ومحلول مصيدة السبن. قامت مصيدة النيتروجين السائل بإزالة الماء من التدفق الرئيسي لدخان السجائر عن طريق التجميد السريع والالتقاط على الجدار الداخلي للأنبوب الزجاجي. وقد أدى ذلك إلى تحسين إشارات ESR بشكل كبير وسمح بالحصول على نتائج عالية القابلية للتكرار.

لُوحظت مستويات مختلفة من تأثير الكنس لمضادات الأكسدة النباتية على الجذور الحرة في المرحلة الغازية في الدخان الرئيسي للسجائر، وعُرِضت معدلات الكنس الخاصة بها. أظهر الليكوبين ومستخلص بذور العنب أعلى المعدلات، بينما لُوحظ معدل أقل للبيكنوجينول. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند البدء في تنفيذ الإجراء، من المهم تمرير الدخان عبر مصيدة نيتروجين سائل؛ حيث يؤدي ذلك إلى تحسين جودة أطياف SR وقابلية تكرار النتائج بمجرد تطويرها. وقد ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجالي الصحة والبيئة على استكشاف وتعزيز الكشف عن الجذور الحرة المهددة للصحة في مختلف المركبات المتطايرة.

بعد مشاهدة الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير كمية الجذور الحرة في دخان التبغ السائد من أجل تقليل الآثار الضارة للتدخين.