رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم

يسمح هذا الإجراء بمراقبة موت الخلايا الدبقية oligo DDR في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا أولا ، ثم يتم تحضير الخلايا لتصوير الخلايا الحية. الخطوة التالية هي توفير علاج للخلايا ومراقبة التأثيرات باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

الخطوة الأخيرة هي إجراء تحليل البيانات. في النهاية ، تظهر النتائج معدلات موت الخلايا في مجموعة الخلايا بعد العلاج أو التحفيز عن طريق مراقبة التألق النووي من صبغة فلورو المنشطة من الكاسباز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التلوين المناعي ، هي القدرة على جمع نقاط زمنية متعددة في وقت واحد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية ، مثل الاستجابات للعلاجات الدوائية والكواشف والعلاجات المختلفة. الآن ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للموت داخل مزارع الخلايا. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الأنسجة العضوية ، بما في ذلك شرائح الدماغ.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة أثناء تكيفهم مع العمل مع الأنسجة الحية بدلا من الأنسجة الثابتة. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا مهما نظرا لوجود الكثير من الخطوات لإعداد عينات الخلايا الحية مقارنة بالأنسجة الثابتة. أول ذوبان الجليد المجمد N 19 oligo droog الخلايا الدبقية في حمام مائي 37 درجة مئوية أثناء ذوبان الخلايا.

أضف سبعة ملليلتر من DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى طبق مزرعة 10 سنتيمترات. ثم أضف معلق الخلية بالتنقيط إلى اللوحة وحرك طبق بتري برفق لتفريق الخلايا بالتساوي. استزراع الخلايا عند 34 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5 سنتات لمدة أربع ساعات بعد أربع ساعات.

قم بشفط الوسائط من اللوحات لإزالة أي DMSO متبقي. الواقي من التجميد. استبدلها بسبعة ملليلتر من الوسائط الطازجة بعد أربعة إلى سبعة أيام من النمو. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء ، قم بشفط الوسائط وقم بإدخال مليلتر واحد من القطرات على ورقة الخلية ، واحتضان درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم قم بحصاد الخلايا التالية ، وهي طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم مع الخلايا المحصودة بكثافة 0.1 في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر ، وضع هذا الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد تدليك آخر ، يمكن طلاء الخلايا لتجارب تصوير الخلايا الحية. للقيام بذلك ، قم بحصاد الخلايا كما كان من قبل ، ثم قم بإزالة 30 ميكرولترا من تعليق الخلية وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لوضع زلات غطاء زجاجي غير مطلي. في آبار صفيحة من ستة آبار ، أضف الخلايا إلى البئر بكثافة 0.1 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. في ملليلترين من وسائط الجلوكوز المرتفعة DMEM الخالية من الفينول ، المكملة ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين تسمح للخلايا بالنمو بين عشية وضحاها عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل التعدين.

في اليوم التالي ، امزج 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل 0.5 إلى أربعة ميكروغرام من البلازميد المنقى والحمض النووي وأربعة ميكرولترات من جين FU hd. قم بدوامة الخليط برفق مرتين ثم اترك الحمض النووي يتعقد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد انقضاء وقت الحضانة ، أضف خليط الحمض النووي عالي الدقة لجين FU مباشرة إلى الخلايا المستنبتة.

قم بإمالة الطبق برفق للخلط. ثم زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل العلاج أو التجريب. قم أولا بتشغيل صندوق التحكم في أداة الخلية الحية الخفيفة LCI Cham.

يجب أن يتم ذلك قبل ثلاث ساعات من بدء التجربة لضمان الاحترار الشامل للمرحلة. كحد أدنى ، يجب تشغيل مربع التحكم قبل ساعة واحدة من بدء التجربة. بعد ذلك ، من خلال العمل في غطاء التدفق ، قم برش غرفة الثقافة والملقط من النوع المغناطيسي الخفيف LCI Cham بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وفحصها تحت المجهر للتأكد من صحتها. يجب أن تظهر الخلايا ديورانت وتنتشر جيدا على زلة الغطاء الزجاجي مع العديد من عمليات الغشاء. من المحتمل أن تكون الخلايا ذات العدد المنخفض من امتدادات العملية أو النواة غير المنتظمة الشكل مجهدة من التعدي وتكون غير مناسبة لمزيد من التجارب التي تعمل في غطاء التدفق.

قم بإمالة لوحة الآبار الستة وإزالة زلة الغطاء بالملقط. ضع جانب خلية انزلاق الغطاء بسرعة لأعلى في اللوحة السفلية للغرفة. لا تدع الغطاء ينزلق حتى يجف.

بعد ذلك ، قم بإرفاق الجسم الرئيسي المغناطيسي لغرفة الثقافة وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط من لوحة الآبار الستة الأصلية إلى الجزء العلوي من زلة الغطاء. تقلل إعادة استخدام الوسائط من مقدار الضغط الواقع على الخلايا بسبب التغيرات البيئية ويمكن أن تكون مفيدة أيضا لتقييم العوامل المفرزة خارج الخلية. بعد إضافة الوسائط ، ضع الغطاء الزجاجي على غرفة الثقافة واستخدم جديلة مناديل كيم بنسبة 70٪ لإزالة أي مادة متبقية يمكن أن تتداخل مع الفحص المجهري من أسفل زلة الغطاء.

ضع حجرة الاستزراع في حاضنة 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ستضمن هذه الخطوة أن الغرفة نفسها تسخن 34 درجة لتقليل إزاحة انزلاق الغطاء. مع ارتفاع درجة حرارة المعدن ، من الضروري العمل مع إضاءة الغرفة المحيطة بأقل قدر ممكن من الخطوات التالية.

أولا ، أعدت Thora مسبقا elequa لعرض نووي في درجة حرارة الغرفة. ثم استرجع غرفة الثقافة من الحاضنة وضعها بسرعة في الغرفة البيئية للمجهر. قم بتشغيل خزان ثاني أكسيد الكربون المختلط مسبقا بنسبة 5٪ مع منظم مزدوج.

بعد ذلك ، باستخدام هدف 10 مرات مع ضبط مصباح المجهر على حوالي 2.5 فولت ووقت التعرض إلى 240 مللي ثانية. التركيز باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع لتصور الخلايا على شاشة الكمبيوتر. ثم أضف تركيزا 80 ملليمولار من أيون البوتاسيوم أو محفز موت الخلايا المبرمج الآخر إلى الخلايا عبر تبادل الوسائط مع التروية البطيئة والمحلية باستخدام مضخة تمعجية.

الركيزة ذات العرض النووي 4 88 مستقرة في زراعة الخلايا للتجارب التي تستمر لمدة تصل إلى 36 ساعة. لذلك ، من الممكن إجراء التجارب خلال هذه الفترة الزمنية. قم أولا بإعداد المجهر لتصور التألق من بروتين الفلورسنت الأحمر والأخضر.

ثم انقر فوق القناة الحمراء لعرض الخلايا المنقولة. حدد واحفظ ما يقرب من 12 إطارا حيث يوجد العديد من الخلايا المنقولة واحفظ نقاط مرحلة XY هذه. اطلب من المجهر التقاط الصور في القناة الحمراء الساطعة والقناة الخضراء في نقاط المرحلة المحفوظة كل ست دقائق.

بعد جمع نقاط XY متعددة من التجارب المكررة أو الثلاثية ، قم بتجميع البيانات من تجارب منفصلة أجريت في أيام مختلفة وقم بإجراء تحليل البيانات والاختبار الإحصائي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب لمقارنة نسبة الخلايا السلبية لخليج CASP إلى الخلايا الإيجابية لخليج CASP. يمكن أن يشير عرض Nuke view 4 88 إلى زيادة معدل موت الخلايا المبرمج لمزارع الخلايا الدبقية N 19 oligo DDR. بعد علاج بتركيز مرتفع من البوتاسيوم خارج الخلية ، تم الحصول على هذه الصور الأساسية باستخدام هدف 10 مرات.

تم نقل خلايا N 19 باستخدام RFP وتمت معالجتها إما بعرض نووي بثلاثة ميكرولتر ، أو 4 88 ركيزة لخلايا التحكم ، أو ثلاثة ميكرولترات من عرض نووي ، و 4 88 ركيزة و 80 مليمولر بوتاسيوم. توضح هذه الصور أن عدد الخلايا المبرمجة يزداد بمرور الوقت ، بعد ثلاث وست وتسع ساعات من العلاج ب 80 مليمولار من البوتاسيوم في ظل ظروف التحكم ، ولم يتم ملاحظة كميات كبيرة من موت الخلايا المبرمج مقارنة بالمزارع المعالجة بالبوتاسيوم 80 ملليمولار. تشير الإشارة الخضراء الخلفية التي لوحظت في ظروف التحكم إلى الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج دون إضافة البوتاسيوم خارج الخلية.

دورة تدريبية مدتها 12 ساعة كافية للدراسات التي تنطوي على إهانات عصبية بعد 12 ساعة ، أظهرت الثقافات المعالجة بالبوتاسيوم ما يقرب من 45٪ من موت الخلايا. عمليا لا تظهر أي من الخلايا في تجربة التحكم موت الخلايا المبرمج بحلول النقطة الزمنية البالغة 12 ساعة. على الرغم من أنه في حالات أخرى ، قد تكون التجارب مطلوبة لتستمر لفترة أطول.

يوضح هذا الرسم البياني الزيادة في ثلاث خلايا موجبة كاسباز على مدار الفترة الزمنية للتجربة التي استمرت 12 ساعة. بمجرد مضايقتها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة ويمكن جمع البيانات بين عشية وضحاها إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون متسقا بين العلاجات باتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى مثل التلوين المناعي للنظر في البروتينات النهائية الأخرى المشاركة في المسارات المدروسة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات للتصوير. احصل على مجموعة بيانات وحلل بياناتك.