[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد منظمات ما بعد الجنين للتعبير عن البروتين وتوطينه في أناقة C باستخدام شاشة جينومية قائمة على الحمض النووي الريبي وبروتينات ذات علامات فلورية. بمجرد إنشاء سلالة الفحص المناسبة ، يتم اختيار مكتبة RNAi. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تعبئة استنساخ المكتبة في بكتيريا.

ثم يتم اختيار البكتيريا ونموها وإطعامها الديدان الخيطية الأنيقة المرحلية. بعد السماح للديدان الخيطية بالنمو لمدة 72 ساعة ، لوحظت حدوث تغييرات في النمط الظاهري محل الاهتمام. في النهاية ، يتم تصور التغييرات في التعبير أو التوطين تحت الخلوي للبروتين المهاجم من خلال الفحص المجهري الفلوري.

يمكن لهذه الطريقة تحديد الجينات المطلوبة للتوطين الصحيح تحت الخلية لبروتين مميز بالفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتحديد الجينات التي تؤثر على الأنماط الظاهرية الأخرى بعد الجنين ذات الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات المنشورة الحالية هي أننا قمنا بتحسين اتساق ومستوى استجابة الحمض النووي الريبي في عن طريق تحفيز إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في البكتيريا قبل الطلاء.

عرض الإجراء سيكون كاثي ضجة ، باحثة مشاركة من مختبري في غضون شهرين من بدء التجربة ، قم بإعداد مكتبة الاستنساخ الأولى من البكتيريا الخطية الأولى من مستنسخات مكتبة التغذية المختارة ، بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية على ألواح التتراسيكلين الكربونية LB. للحصول على تحكم إيجابي ، استخدم استنساخا يحتوي على جين ينتج نمطا ظاهريا يعتمد على الجرعة بعد الجنين ، مثل BLE أربعة. بالنسبة للتحكم السلبي ، استخدم متجه فارغا أو استنساخا يحتوي على جين كاذب متوقع بدون أنماط ظاهرية ملحوظة.

احتضان الألواح بين عشية وضحاها لكل استنساخ تلقيح ملليلترين من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر. حمض الكربونيك مع مستعمرة واحدة من صفائح الخطوط ، يحتضن الثقافات بين عشية وضحاها مع التحريض في صباح اليوم التالي. يجب أن تكون المحاليل غائمة ، وإنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل عن طريق إضافة IPTG إلى الثقافات واحتضانها لمدة أربع إلى خمس ساعات إضافية في ظل نفس الظروف.

إضافة IPTG ضربة قاضية أكثر اتساقا وقوة ناتجة عن RNAI للمنتج الجيني بدلا من الاعتماد فقط على IPTG ومثقاب لوحة NGM بعد حضانة IPTG بقعة 30 ميكرولترا من الثقافة من كل استنساخ في كل بئر من ألواح NGM RNAi المحضرة 24 بئرا. استنساخ واحد لكل بئر. يجب أن تحتوي كل لوحة على بئرين مخصصين لعناصر التحكم.

حدد بعناية موقع كل مكتبة. الاستنساخ في 24 لوحة بئر الآن ضع الألواح مكشوفة في غطاء تدفق معقم حتى تجف لمدة 20 دقيقة تقريبا. لا تسمح لحواف الأجار بالابتعاد عن اللوحة.

بمجرد تجفيفها في الديدان الخيطية المرحلية على الأطباق ، يتم إعطاء تعليمات حول تحضير الديدان الخيطية. في القسم التالي ، ابدأ بمجموعة مرحلية من المرحلة اليرقية الأولى أو الديدان الخيطية L one. بدءا من L ، تتجاوز اليرقات الواحدة الأنماط الظاهرية الجنينية المميتة المحتملة.

إن وجود مجموعة من على مراحل للفحص يزيد أيضا من ثقة المرء في أن أي اختلافات تظهر ناتجة عن الحمض النووي الريبي وليست مجرد اختلافات طبيعية تحدث في مراحل مختلفة. ومع ذلك ، إذا تسبب الحمض النووي الريبي في حدوث تأخر في النمو ، فيجب ملاحظة ذلك من قبل الفاحص Bleach. مجموعة مختلطة من سلالة الفحص.

فقط الأجنة المحمية بقشر البيض ستنجو من هذه المرحلة من في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها عند 20 درجة مئوية أو في غضون 18 ساعة. إذا أجريت عند 16 درجة مئوية في اليوم الذي يتم فيه تلقيح المزارع البكتيرية. اختر ثلاث ألواح بحجم 100 ملم من سلالة الفحص التي تتمتع بصحة جيدة وتحتوي على كل من الجاذبية والبالغين والأجنة.

اغسل جميع في وسائط M تسعة معقمة وانقل الغسيل إلى أنبوب معقم سعة 15 مليلتر بغطاء لولبي. إذا كان الغسيل أكبر من 3.5 ملليلتر ، فقم بتدوير وإزالة كل السائل باستثناء 3.5 مل. إذا كان أقل من 3.5 ملليلتر.

قم بزيادة الحجم إلى 3.5 مل بالماء أو M تسعة لتحرير الأجنة من البالغين عند 1.5 مل من خليط هيدروكسيد الصوديوم والمبيض لكل غسلة. اسمح للحيوانات بالحضانة لمدة لا تزيد عن 10 دقائق في هذا المحلول. بعد بدء المؤقت ، قم بتدوير كل أنبوب لمدة 10 ثوان وكرر الدوامة كل دقيقتين.

بعد كل دوامة ، راقب المحلول تحت نطاق تشريح جثث. في غضون ست إلى ثماني دقائق ، سيتم تفتيت البالغين ويجب إطلاق الأجنة. قم بإزالة الأجنة من محلول التبييض عن طريق تكويرها وإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.

ثم أعد تعليق الحبيبات بحجم 10 ملليلتر عن طريق إضافة M تسعة معقمة واستخدام التحريض. كرر عملية الغسيل هذه مرة أخرى على الأقل حتى تصبح رائحة المبيض غير قابلة للكشف تماما. أن أكثر إحكام مرحلة يعتقلهم في هم [ل] مرحلة واحدة عن طريق تفقيس أجنة في [م] تسعة وسط دون طعام.

يتم ذلك عن طريق نقل الأجنة في M تسعة إلى قارورة إرلينماير صغيرة. رج القارورة طوال الليل في درجة الحرارة المناسبة للسلالة والتجربة. في هذا الوقت ، سوف تفقس جميع وتعتقل في L واحد في اليوم التالي.

استأنف نمو اليرقات من نقطة زمنية محددة عن طريق نقلها إلى البكتيريا المحضرة التي تعبر عن RN مزدوج الشريطة. هذا هو نفس اليوم الذي تم فيه رصد 24 لوحة بئر بالبكتيريا. ابدأ بنقل L one إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وتدويرها لأسفل. ثم ركز في نصف إلى مليلتر واحد من M تسعة وضع خمسة ميكرولترات من الديدان الخيطية المركزة على طبق.

احسب عدد على اللوحة واضبط محلول الديدان الخيطية المركز. TE 30 دودة لكل ثلاثة إلى 10 ميكرولترات. أخيرا ، اكتشف ما يقرب من 30 لترا من المرحلة الواحدة على البكتيريا في كل بئر من البكتيريا المحضرة.

24 صفيحة بئر أكثر من 30 لكل بئر قد تؤدي إلى الجوع بعد أن تجف البقع ، الأمر الذي سيستغرق بضع دقائق ، قم بتأمين الغطاء بالشريط المطاطي واحتضان مقلوبة عند درجة الحرارة والمدة المطلوبة لتسجيل في المرحلة المطلوبة. بمجرد أن تصبح الديدان الخيطية جاهزة للفحص ، تأكد من أن عناصر التحكم الإيجابية والسلبية تنتج الأنماط الظاهرية المتوقعة. ثم راقب التجارب بحثا عن تشوهات النمو.

بعد ذلك ، باستخدام مجهر تشريح ، قم بتركيب ثمانية إلى 12 من كل بئر على شرائح AGRI PET بنسبة 4٪ مع قطرة خمسة ميكرولتر من التخدير. بعد تطبيق قسيمة الغطاء المناسبة ، قم بعمل ملاحظات على خمسة على الأقل باستخدام الفحص المجهري المركب. احتفظ بقاعدة بيانات منظمة للجين وعدد التي لوحظت ونتائج النمط الظاهري.

لكل تجربة RNAI ، تحقق من أي نمط ظاهري ينتج عن RNAi بواسطة نمط ظاهري ثانوي آخر إن أمكن ، ومن خلال تكرار التجربة ، يمكن للتجارب المتكررة استخدام البكتيريا من نفس الخط. قد تؤدي الخطوط القديمة إلى ضعف النمو في الثقافات السائلة بين عشية وضحاها ، ويجب إعادة خطها أولا. لن تنمو بعض الثقافات البكتيرية بشكل جيد بسبب المنتج الجيني المعبر عنه في البلازميد.

في هذه الحالة ، ما عليك سوى تركيز البكتيريا قبل الطلاء. بالنسبة للشاشة المستمرة ، من المهم الاحتفاظ بالكثير من الأجنة جاهزة دائما للتدريج. يجب دائما تغذية سلالة الفحص ، وليس تجويعاها ، وخالية من الملوثات التي قد تؤثر على النمط الظاهري محل الاهتمام.

وضعنا جدولا زمنيا للصيانة لتغذية. تم تحديد الجينات التي تؤثر على توطين DBL واحد بواسطة RNAi باستخدام تصميم سلالة لهذه الشاشة. يتضمن التعبير الطبيعي لعلامة GFP dbl one أجسام خلايا الحبل العصبي البطني ، وصفا من puncti التي تغذى على RA مضاد للحساسية إلى DBL.

أظهر واحد mRNA تعبيرا مخففا بشدة عن DBL واحد. كانت هذه أيضا صغيرة مثل التي تفتقر إلى وظيفة DBL L واحد. نجح فحص الحمض النووي الريبي I في تحديد العديد من الجينات الأخرى التي تؤثر منتجاتها على توطين DBL واحد ، وبالتالي توسيع فهمنا لكيفية تهريب TGF beta تحت الخلايا وتوفير نقطة انطلاق للعديد من التحقيقات.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن لشخص واحد أن ينظم ويراقب مجموعتين إلى أربع مجموعات من التجارب كل أسبوع. على سبيل المثال ، يمكن ملاحظة التي يتم تنظيمها يومي الاثنين والثلاثاء يومي الخميس والجمعة على التوالي ، ويمكن تنظيم مرة أخرى يومي الجمعة والسبت يومي الاثنين والثلاثاء. الملاحظة أثناء اتباع هذا الإجراء في جميع أنحاء شاشتك.

من المهم الاحتفاظ بالكثير من الأجنة جاهزة للتدريج ، لذا حافظ على سلالة الفحص بانتظام. أيضا ، من المهم تدوين ملاحظات مفصلة حول جميع الملاحظات.