الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل وظيفة الجينات بطريقة كمية ورصد التأثيرات على نطاق الجينوم بأكمله. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيط تعبير كل جين باستخدام RNAi في أطباق ذات 96 بئراً.

بعد ذلك، يتم إجراء الاختبار المناسب لوظيفة الجين. في هذا المثال، يتم تقييم قدرة sea elegance على الاستجابة الطبيعية للعدوى الفطرية من خلال تحليل تعبير مراسل فلوري قابل للتحفيز. ثم يتم إجراء تحليل كمي مؤتمت باستخدام Coss bio sortt، وفي النهاية، يظهر تحليل السمات القابلة للقياس، مثل تعبير جين مراسل فلوري، مجموعات فرعية من الجينات المطلوبة لتعديل مسارات محددة، أو التحكم في النمو أو السلوك أو الفسيولوجيا.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات متنوعة تتسم بالدقة، مثل التطور، وعلم الأحياء العصبي، بالإضافة إلى التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما نشر مختبر Oranger أولى عمليات فحص RNA واسعة النطاق. وقد تطلب الأمر جهداً كبيراً لتطوير الأدوات اللازمة وإتقان عملية الأتمتة.

سأقوم بشرح الإجراء بالتعاون مع أوليفيا تي، وهي عالمة موظفة ومساعدة أبحاث من مختبر جوناثان يوبانكس. لتحضير من 10 إلى 12 طبقاً من نوع 96 well plates، ابدأ بتجهيز 100 milliliters من وسط نمو النيماتودا أو NGM في ماء منزوع الأيونات. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب للحصول على التعليمات.

بينما لا يزال الوسط دافئاً، أضف 100 µg/mL من ampicillin، و12.5 µg/mL من tetracycline، و4 mM من IPTG، ثم وزع بسرعة 75 µL في كل بئر من طبق 96 well flat bottom plate. تحقق من وجود أي فقاعات هواء في الآبار وقم بإزالتها فوراً. تُحفظ الأطباق في غرفة رطبة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، قم بتجهيز أطباق ذات 96 بئراً عميقة عن طريق إضافة 1.5 milliliters من وسط LB المحتوي على ampicillin وtetracycline. أضف ملصقاً فريداً أو رمزاً شريطياً (barcode) لكل بئر. غطِّ كل طبق واحفظه في درجة حرارة أربع degrees centigrade إذا تم تجهيزه مسبقاً، ثم قم برج لوحة مخزون LB ذات 96 بئراً التي تحتوي على RNAI.

يتم تحضير المستنسخات البكتيرية باستخدام الأمبيسيلين والتتراسايكلين والجلسرول، وتوزيع 3 µL من كل مستنسخ بكتيري على البئر المقابل في طبق 96 بئرًا عميقًا تم تحضيره مسبقًا. تُستخدم الآبار الفارغة كمجموعات ضابطة، ثم تُغطى أطباق الآبار العميقة بغشاء لاصق وتُحضن طوال الليل عند 37 °C مع الرج. وفي صباح اليوم التالي للاستزراع، يُنقل طبق المكررات المكون من 96 بئرًا إلى درجة حرارة -80 °C.

انقل أطباق NGM ذات 96 بئراً من درجة حرارة 4 °C إلى خزانة تدفق صفائحي معقمة، واتركها لتسخن وتجف لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة. ثم أضف الملصق أو الرمز الشريطي المناسب إلى كل طبق. استخرج أطباق المزارع الليلية ذات 96 بئراً عميقاً من الحاضنة.

لاحظ عملية طرد المزارع البكتيرية النامية بنجاح مركزياً. يتم وضع أطباق الآبار العميقة ذات الـ 96 بئراً لمدة خمس دقائق بسرعة 4,000 RPM. قم بالتخلص من الطافي عن طريق قلب الطبق بحدة رأساً على عقب وتجفيفه بسرعة.

قم بإعادة تعليق الراسب البكتيري في السائل المتبقي عن طريق وضع حواف الطبق على منشفة ورقية واستخدام جهاز هزاز (vortex). ويُفضل استخدام جهاز تحريك مخصص لضمان تلقي كل طبق لنفس المعاملة بدقة. انقل 5 µL من البكتيريا المعاد تعليقها إلى أطباق NGM ذات 96 بئرًا باستخدام ماصة متعددة القنوات (8 أو 12 قناة).

تجنب لمس وسط NGM. اترك البكتيريا لتجف تحت خزانة تدفق صفائحي معقمة لمدة ساعتين تقريبًا. مع التحقق بانتظام لتجنب جفاف وسط NGM بشكل مفرط، يتم تحضين أطباق RNAi NGM ذات 96 بئرًا عند 37 °C طوال الليل في غرفة رطبة.

ارجع إلى البروتوكول المكتوب لتحضير مجموعة متزامنة من الديدان بعد تبريد أطباق R-N-A-I-N-G-M ذات الـ 96 بئراً في درجة حرارة الغرفة. أضف ما يقرب من 100 إلى 200 دودة في 2 µL من M9 إلى كل بئر، وتحقق من وجود ديدان في كل بئر.

يجب أن تكون الديدان في حالة سباحة. تُترك الأطباق لتجف تحت خزانة تدفق صفائحي معقمة لمدة لا تتجاوز ساعة واحدة. يتم فحص الأطباق بشكل منتظم.

يجب أن تكون الديدان في حالة زحف بدلاً من السباحة. ضع الأطباق في غرفة رطبة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية طوال الليل. بعد اختيار دفعة عالية العدوى من *Judge Miria spora*.

استخدم Buffer M9 لجمع الأبواغ من طبق قطره 9 سم. وزع 4 µL من الأبواغ في كل بئر وتحقق من وجود الأبواغ في كل بئر. يجب أن تكون الديدان في حالة سباحة.

اترك الأطباق لتجف تحت خزانة تدفق صفائحي معقمة لمدة ساعة واحدة تقريبًا. افحص الأطباق بانتظام حتى تبدأ الديدان في الزحف. بعد ذلك، ضع الأطباق المصابة في غرفة رطبة عند 25 درجة مئوية طوال الليل.

افحص الديدان قبل التحليل من خلال ملاحظتها سريعاً تحت مجهر فلوري للتأكد من نموها بنجاح، ومن حدوث تحفيز جيد لبروتين GFP في آبار الضابط السالب، وانخفاض فلورة GFP في آبار الضابط الموجب. إذا كان التحفيز جيداً، استخدم ماصة متعددة القنوات (بثماني أو 12 قناة) لنقل الديدان مع 100 µL من NACL بتركيز 50 mM و 0.05% triton إلى طبق جديد ذو قاع مستدير مكون من 96 بئراً وموسوم أو يحتوي على رمز شريطي.

قم بتجميد الأطباق عند درجة حرارة 80- °C حتى موعد التحليل، وفي يوم التحليل قم بإذابة الأطباق المجمدة في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد ذوبان الأطباق، انتقل إلى التحليل الآلي باستخدام نظام COPA bios.

يقوم جهاز Sortt بمعالجة الطبق بئرًا تلو الآخر وتحليل معايير كل دودة، مثل تألقها الفلوري. قم بنقل المعلومات التي تم الحصول عليها من جهاز COPA bios sortt إلى ملف Excel للتحقق من جودة البيانات. ثم قم بتخزين البيانات الخام، بما في ذلك الكثافة الضوئية، والطول المحوري، والانبعاثات الفلورية في حزمة limbs لإجراء تحليلات كمية مفصلة لاحقًا.

في هذه التجربة، عبرت الديدان المعدلة وراثياً بشكل تأسيسي عن مراسل P call 12 ds red ومراسل PNLP 29 GFP القابل للاستحثاث. عُرّضت الديدان المراسلة لمجموعة ضابطة أو لمستنبت خلوي A-G-F-P-R-N-A لمدة 48 ساعة. تمثل اللوحات الموجودة على اليسار الديدان غير المصابة، بينما تمثل اللوحات الموجودة على اليمين الديدان بعد 18 ساعة من الإصابة بـ D spora.

عندما يكون النمط الظاهري المستهدف هو تعبير مراسل GFP، فإن الآبار التي تحتوي على استنساخ GFP RNAi توفر ضابطاً قوياً. ينتج نظام COPA bios SORTT بيانات عددية لكل دودة تم تحليلها. وتوضح هذه الرسوم البيانية المتوسط والانحراف المعياري لكل بئر من الديدان المعدلة وراثياً.

التعبير التأسيسي لمراسل p call 12 DS red ومراسل PNLP 29 GFP القابل للتحفيز بعد RNAI والعدوى بـ diaspora. يقوم جهاز الفرز بتحليل زمن الطيران أو TOF، والذي يتوافق مع حجم الديدان، والفلورة الحمراء، ونسبة الفلورة الخضراء إلى TOF. تسبب بعض المستنسخات عيوباً في النمو و/أو تؤثر على تعبير P 12 DS red.

وتؤثر عوامل أخرى بشكل خاص على تعبير البروتينات الفلورية (FP). على سبيل المثال، يستهدف هذا النسل المستنسخ (clone) المحدد الجين NS Y الذي ثبت سابقاً أهميته في تنظيم NLP 29. ويتم قياس الفلورة الخضراء والحمراء وTOF بوحدات اعتباطية ولكن ثابتة.

تتمثل إحدى ابتكارات هذا البروتوكول في استخدام ألواح التجميد لتأجيل تحليلها. يتيح التجميد تخزين الألواح لمدة تصل إلى أسبوعين دون تغيير النتائج بشكل جوهري كما هو موضح هنا. ورغم أن القيم المطلقة للفلورة المقاسة قد تتغير، إلا أن نسبها النسبية تظل متشابهة.

تم إصابة أربع ديدان تحمل الجينات المنقولة PNLP 29 GFP و P call 12 ds red ببكتيريا diaspora أو عدم إصابتها. وبعد مرور 18 ساعة، تم تقسيم كل طبق تقريبًا إلى نصفين؛ حيث حُلل النصف الأول فورًا، بينما جُمد النصف الآخر عند درجة حرارة -80 °C لمدة 24 ساعة قبل إذابته. وجرى حساب قيم التحليل لمتوسط الحجم، والعتامة، والفلورة الخضراء والحمراء لكل عينة.

يوضح الرسم البياني نسبة المتوسط للعينات المصابة مقسومة على العينات غير المصابة لكل من العينات المجمدة والحية الموضحة هنا. ومن تحليلات مكررة للوح تمثيلي، تظهر نسب الفلورة المُطبعة لكل بئر، وهي تمثل متوسط الفلورة للبئر مقسوماً على المتوسط المقتطع للوح. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن لمجموعة مكونة من شخصين إلى ثلاثة أشخاص إجراء فحص شامل للجينوم في غضون شهرين إلى ثلاثة أشهر.

يتطلب التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول الكثير من العمل الجماعي الجيد. وقد بذل أعضاء مجموعتي جهوداً هائلة لإعداد بروتوكول فعال وسهل التنفيذ نسبيًا.