فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مقاييس المحتوى العالي في نماذج الأمراض الخلوية لتقدير المسارات المتأثرة في الأمراض التنكسية العصبية. ولتحقيق ذلك، يتم إدخال نموذج خلوي للنمط الظاهري للمرض في نظام استنبات الخلايا الآلي، وتُحضن الخلايا حتى الوصول إلى عدد الخلايا المطلوب. بعد ذلك، يتم تقسيم الخلايا وعدّها وتوزيعها في أطباق ذات 96 بئراً تحتوي على فيروسات لينتيفيروس تعبر عن أنواع مختلفة من SH RNAs.

بعد ستة أيام من التمايز الخلوي، تُخرج الخلايا من النظام لإجراء الصبغ المناعي والتصوير عالي المحتوى. وأخيراً، يتم تحليل الصور باستخدام مجموعة متنوعة من خوارزميات التحليل لتقدير السمات المتعلقة بصحة الخلايا، مثل النمو العصبي ووظيفة الميتوكوندريا.

تُحلل النتائج أيضاً باستخدام تحليل التباين الثنائي (two-way ANOVA) في برنامج Novas لتحديد تأثيرات التفاعل ذات الدلالة الإحصائية. يمكن لهذه الطريقة أن تعجل في الإجابة على الأسئلة الجوهرية المتعلقة بوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض والمسارات التي تعمل ضمنها بشكل عام. وسيؤدي ذلك لاحقاً إلى فهم أفضل للآليات الإمراضية المشاركة في الأمراض التنكسية العصبية.

لبدء عملية زراعة الخلايا، قم بتجهيز نظام زراعة الخلايا الآلي لإدخال أطباق زراعة الخلايا. قم بتحميل المستهلكات مثل رؤوس الماصات، وأطباق زراعة الخلايا، وأطباق المقايسة في النظام. تأكد أيضاً من وجود كمية كافية من وسط زراعة الخلايا و PBS والتربسين في النظام يدوياً.

قم بزراعة لوحين من أطباق omni tray بمعدل 2 × 10⁶ خلية لكل طبق من خط خلايا الورم الأرومي العصبي SH SY five Y. حافظ على الخلايا في أوساط نمو مثالية تحتوي على 10% fetal bovine serum FBS، ثم ضع الأطباق على رف الإدخال في روبوت زراعة الخلايا. باستخدام واجهة المستخدم الرسومية gui، اختر بروتوكول زراعة الخلايا الملتصقة A adherent cell culture، وقم بتعديل ملفات المعاملات الخاصة بخط الخلايا الملتصقة بحيث يتم ضبط عتبة الالتحام عند 70%.

يبلغ إجمالي وقت التحضير دقيقتين. وجه النظام لتحضير أطباق Omni tray جديدة بكثافة خلايا تبلغ 2 × 10⁶ خلية لكل طبق. وجه النظام لتحضير أطباق المقايسة لكل طبق Omni tray بحيث تحتوي كل بئر على إجمالي 5,000 خلية، ثم قم بحضن الخلايا عند 37 °C و5% CO2.

تتضمن هذه البروتوكول الخاص بمستنبتات الخلايا الملتصقة الخطوات التالية. يتم تحضين الأطباق وتصويرها حتى تصل الخلايا إلى عتبة الالتحام المحددة مسبقاً. وفي حال عدم وصول الخلايا إلى عتبة الالتحام في غضون خمس قراءات، يتم إخراج الأطباق من النظام.

عند الوصول إلى حد الالتحام الذي حدده المستخدم، يتم غسل الخلايا، ثم معالجتها بإنزيم التربسين، ثم عدّها. تُضاف كمية محددة مسبقاً من الخلايا إلى أطباق omni trait جديدة، وفي حال توفر أعداد كافية من الخلايا، يتم نقل عدد محدد من أطباق المقايسة إلى المنصة وتوزيع عدد محدد من الخلايا في كل بئر. وأخيراً، يمكن تصوير أطباق المقايسة مباشرة باستخدام المجهر المدمج أو إخراجها من النظام لإجراء مزيد من المعالجة لبدء إجراءات إنتاج الفيروس.

يتم تلقيح وسط LB المحتوي على الأمبيسيلين باستخدام مخزونات الجلسرول البكتيرية التي تحتوي على ناقلات HRNA، وتترك لتنمو طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم طرد الخلايا مركزياً وإزالة السائل الطافي، ثم تُستخلص البلازميدات باستخدام نظام Wizard Magnus لتنقية بلازميد الخلايا. يتم تجميع الحمض النووي البلازميدي النهائي في أطباق ذات 96 بئراً. ويتم إنتاج فيروس lentivirus من نوع S-H-R-N-A باستخدام RNAi consortium، وهو نظام لإنتاج الفيروسات البطيئة في أطباق ذات 96 بئراً. يجب إجراء جميع التجارب في مختبر سلامة من المستوى الثاني ML two أو BSL two، كما يجب تطهير جميع الكواشف والمستهلكات المستخدمة باستخدام الكلور بتركيز 30% بعد الاستخدام.

لن يتم عرض إجراء إنتاج الفيروس البطيء (lentivirus) في هذا الفيديو، ولكنه يستغرق أربعة أيام ويتكون من الخطوات التالية. أولاً، يتم استزراع خلايا التعبئة في اليوم صفر في فترة ما بعد الظهيرة. في اليوم الأول، يتم ترصيف خلايا التعبئة بثلاثة بلازميدات من الفيروس البطيء بعد 18 ساعة من عملية الترصيف.

في اليوم الثاني، يتم استبدال الوسط بوسط جديد يحتوي على نسبة عالية من BSA أو نسبة عالية من المصل. وبعد مرور 24 ساعة على تغيير الوسط، وفي اليوم الثالث، يتم حصاد الفيروس واستبدال الوسط مرة أخرى بوسط جديد يحتوي على نسبة عالية من BSA أو نسبة عالية من المصل.

أخيرًا، بعد مرور 24 ساعة من الحصاد الأول للفيروس، في اليوم الرابع، يتم حصاد الفيروس مرة أخرى والتخلص من خلايا التغليف لحساب تعدد العدوى أو MOI للفيروس lentivirus؛ يتم نقل عدوى خلايا SHSY 5Y باستخدام تخفيفات تسلسلية من الفيروس وتحضين الخلايا عند 37 درجة Celsius لمدة 72 ساعة بعد نقل العدوى. يتم فحص تعبير GFP تحت المجهر وتحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ GFP؛ ثم يتم زرع lentivirus SHRNA في أطباق المقايسة بـ MOI قدره 3. بعد زرع lentivirus SHRNA في أطباق المقايسة، يتم تحميل الأطباق في نظام استزراع الخلايا الآلي لإجراء نقل العدوى بالفيروس lentiviral.

بعد مرور 24 ساعة، سيتم تغيير الأوساط في أطباق المقايسة إلى وسط optimum يحتوي على 0.5%FBS و0.1 micromolar من حمض الريتينويك. لبدء عملية التمايز، استمر في تحضين أطباق المقايسة في أوساط التمايز لمدة خمسة أيام لضمان أقصى حد من تثبيط تعبير الجين المستهدف في اليوم الخامس، ثم أضف H2O إلى نصف أطباق المقايسة لمدة 24 ساعة لتحفيز انتقال بروتين DJ one إلى الميتوكوندريا في اليوم السادس. أضف MIT tracker إلى الخلايا بتركيز نهائي قدره 200 nano molar لكل بئر واحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يمكن نقل الأطباق إلى جهاز التصوير عالي المحتوى (HC) لإجراء التصوير. وبدلاً من ذلك، يمكن إخراج الأطباق من النظام لإجراء معالجات إضافية مثل التلوين المناعي. وبالنسبة للتصوير عالي المحتوى، سيتم تصوير ما مجموعه 30 حقلًا لكل بئر باستخدام عدسة شيئية 20 x، حيث يتم تصوير الميتوكوندريا باستخدام مجموعة مرشحات DJ one، وbeta three tubulin باستخدام مجموعة مرشحات trixy، وS five باستخدام مجموعة مرشحات S five، والنوى باستخدام مجموعة مرشحات UV.

هذا مثال لصور مركبة لخلايا تم الحصول عليها بواسطة التصوير عالي المحتوى. يوضح الشكل ثلاثة خلايا غير معالجة في اللوحة A وخلايا معالجة بـ H2O two في اللوحة B. تم وسم DJ one باللون الأخضر، والميتوكوندريا باللون الأحمر، والنوى باللون الأزرق. لتحديد متوسط معامل التداخل بين DJ one والميتوكوندريا، قم بتحليل الصور باستخدام تطبيق colocalization bio.

حدد مناطق الاهتمام (ROIs) كما يلي: المنطقة ROIA للنواة في الشكل 4 أ و هـ، والمنطقة ROIB للميتوكوندريا في الشكل 4 ب و و، مع استبعاد ROIA من ROIB. ولضمان تحليل السيتوبلازم فقط، حدد الميتوكوندريا كمنطقة الهدف الأولى و DJ1 كمنطقة الهدف الثانية، الشكل 4 ج و ز. قم بتحليل الصور باستخدام تطبيق التحليل المقسم (compartmental analysis bio application) لتحديد متوسط شدة إشارة MIT tracker داخل الميتوكوندريا.

الشكل أربعة B و F لتتبع متوسط أطوال الاستطالات العصبية من صبغ beta three tubulin. قم بتحليل الصور باستخدام تطبيق neuronal profiling bio الشكل أربعة D و H، ثم قم بتصوير ألواح الصور التالية باستخدام القارئ الكونفوكالي الآلي opera lx.

قم بتصوير الميتوكوندريا باستخدام ليزر 561 nanometer والنوى باستخدام صورة استثارة UV. يتم تصوير إجمالي 30 حقلاً لكل بئر باستخدام عدسة شيئية 60 x ذات غمر مائي. وأخيراً، قم بتحليل الصور باستخدام خوارزمية ميزات نسيج SER أو spot edge ridge.

يقوم مرشح حواف SER بنقل الشدة في البكسلات التي تشكل أنماطاً شبيهة بالحواف. وكلما زاد تفتت الميتوكوندريا، ارتفعت درجة حواف SER. في هذا الفيديو، تم استخدام فحوصات المحتوى العالي (HC) لتحديد المغيرات لبروتين DJ-1 الذي يؤدي فقدانه إلى الإصابة بمرض باركنسون المتنحي جسدياً.

توضح هذه النتيجة التمثيلية الأولى تفاعلاً فوق سيادي مع DJ one. يظهر الرسم البياني الشريطي على اليسار وحدات الفلورة المُعايرة، بينما تظهر الصور على اليمين خلايا SHSY five Y مصنفة باللون الأحمر باستخدام mito tracker لتقدير حيوية الخلايا.

لُوحظ أن تثبيط DJ one في الخلايا التي تعرضت للسم أدى إلى فقدان أكبر في حيوية الخلايا مقارنة بالخلايا المصابة بفيروس lentivirus عشوائي. وكان لتثبيط الجين المستهدف A تأثير مشابه لذلك الذي لُوحظ في الخلايا التي تم تثبيط DJ one فيها. ومع ذلك، أدى تثبيط كل من DJ one والجين المستهدف A معاً إلى فقدان في حيوية الخلايا أكبر بكثير مما أدى إليه فقدان أي من الجينين بمفرده، وهو ما يشير إلى وجود تفاعل فوقي (epistatic interaction) بين DJ one والجين المستهدف A. المثال التالي يتناول جيناً ينظم انتقال DJ one.

يوضح الرسم البياني العمودي معامل التداخل الموحد بين DJ one والميتوكوندريا، وهو ما يعكس انتقال DJ one من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا. تمثل اللوحات من A إلى D صوراً لخلايا SHSY five Y مصنفة باللون الأخضر لـ DJ one، والأحمر للميتوكوندريا والأزرق للنوى. عندما تتعرض الخلايا لذيفان، ينتقل DJ one من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا، ويتم قياس ذلك من خلال معامل تداخل أعلى بين DJ one والميتوكوندريا.

في الخلايا التي تم فيها تثبيط الجين المستهدف B بشكل أقل، ينتقل DJ one إلى الميتوكوندريا عند تعريض الخلايا للسم، مما يشير إلى أن الجين المستهدف B يشارك في نقل DJ one إلى الميتوكوندريا. يظهر هنا مثال على جين مشارك في النمو العصبي. تظهر أطوال الاستطالات العصبية المعيرة في الرسم البياني العمودي، وتظهر الخلايا المستخدمة في قياس أطوال الاستطالات العصبية في الصور مع ظهور beta three tubulin باللون الأخضر والنوى باللون الأزرق.

يؤدي تثبيط الجين المستهدف C في خلايا SHSY five Y من النوع البري إلى زيادة ملحوظة في طول الاستطالات العصبية مقارنة بالخلايا المصابة بفيروسات لينتيفيروس التي تعبر عن SH RNA عشوائي. ويفقد هذا التأثير في الخلايا المحضونة مع السم. وأخيراً، تُظهر هذه النتائج مثالاً على جين مشارك في شكل الميتوكوندريا.

توضح الرسوم البيانية متوسط قيم تقسيم حواف الشبكة الإندوبلازمية الملساء في الميتوكوندريا لخلايا SHSY five Y المصابة بـ scrambled HRNA أو A-S-H-R-N-A الذي يستهدف الجين D. الصورة A والصورة C هما صور مركبة لخلايا SHSY five Y المصابة بـ scrambled HRNA أو A-H-R-N-A الذي يستهدف الجين D على التوالي. تظهر الميتوكوندريا باللون الأحمر بينما تظهر النوى باللون الأزرق.

تعد الصورتان B وD تمثيلات مرئية لكمية نتوءات الشبكة الإندوبلازمية الملساء (SER) كما لوحظ هنا. تؤدي عدوى خلايا SHSY five Y من النوع البري باستخدام HRNA الذي يستهدف الجين D إلى زيادة قيمة تقسيم نتوءات SER الميتوكوندرية عند مقارنتها بالخلايا المصابة بفيروسات لينتيفيروس عشوائية (scrambled lentivirus). ويمكن لهذا النهج أن يمهد الطريق للباحثين في مجال التنكس العصبي لاستكشاف وتوصيف المسارات المتضمنة في إمراضية المرض بطريقة فعالة ومنظمة.

سيؤدي ذلك بعد ذلك إلى تحديد أهداف أفضل للتطوير العلاجي.