الكهربائية الميدانية التي تسيطر عليها هجرة إخراج من الخلايا العصبية السلف في البيئات 2D و 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل تأثير المجالات الكهربائية المطبقة على هجرة الخلايا السلفية العصبية في ثقافة ثنائية الأبعاد ونماذج ثلاثية الأبعاد خارج الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا العصبية السلفية العصبية وتوسيعها أولا في المختبر. الخطوة الثانية هي تحضير معلق خلية واحدة من الخلايا السلفية العصبية.

بعد ذلك ، لإعداد ثقافة 2D ، يتم طلاء الخلايا السلفية العصبية في غرف تكتيك كهربائي مصممة خصيصا. بدلا من ذلك ، لإعداد نموذج ثلاثي الأبعاد خارج الجسم الحي ، يتم تصنيف الخلايا السلفية العصبية بخطافات 3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 2 ، ويتم حقنها في نموذج عضوي لشريحة الحبل الشوكي. في النهاية ، يتم تطبيق مجال كهربائي على الغرف الكهربائية ويتم إجراء تسجيل الفاصل الزمني لإظهار أن الخلايا السلفية تهاجر نحو كاثود المجال الكهربائي في كل من البيئات ثنائية الأبعاد و 3D.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة جديدة للتتبع المباشر للهجرة المستحثة في المجال الكهربائي للخلايا الفردية بعد الزرع في نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد ، يشبه إلى حد كبير البيئة الطبيعية. لا يمكن أن توفر هذه الطريقة فقط إدخال في التقنية الكهربائية ، وهجرة الخلايا العصبية المزروعة في شريحة الحبل الشوكي ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على الأنظمة الأخرى التي مثل نماذج شريحة الدماغ الصغيرة. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد شرائط زجاجية مقاس 22 × 11 ملم عن طريق قسمة الأوتوكلاف 22 على 22 ملم.

ينزلق الغطاء السماكة رقم واحد إلى النصف باستخدام قلم ماسي. بعد ذلك ، قم بإنشاء بئر زجاجي قائم بذاته بأبعاد داخلية ، 22 × 10 ملم عن طريق لصق أربعة عموديا ، تقف شرائط 22 × 11 ملم مع شحم سيليكون عالي الفراغ ، مما يسمح للبئر بالجفاف تماما والتصلب طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإرفاق 2 22 × 11 ملم شرائط زجاجية موازية لبعضها البعض ، مع ترك فجوة قدرها 10 ملم إلى قاعدة طبق استزراع 100 ملم باستخدام شحم السيليكون.

ثم أغلق المنطقة الواقعة بين هذه الشرائط عن طريق ربط زلة غطاء مقاس 22 × 22 ملم بشحم السيليكون. ضع الزجاج جيدا على زلات الغطاء بحيث تخلق الجدران الداخلية مساحة ضيقة لزرع الخلايا. مقاومة للماء لجميع الوصلات بشحم السيليكون.

قم بتغطية هذه المنطقة المحصورة بالتتابع ب poly de lycine ، متبوعا ب laminin كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. في هذا الإجراء ، احصل على الأدمغة من E 14 إلى E 16 الفئران وضعها في وسط قاعدي بارد D-M-E-M-F 12. بعد ذلك ، قم بإزالة السحايا تحت المجهر التشريحي.

بعد ذلك ، انقل الأدمغة إلى طبق بتري 35 ملم. استخدم الملقط الدقيق لفصل الأدمغة إلى شظايا الأنسجة. ثم انقلها إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي سعة 15 مل.

العينات عند 800 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق لإزالة الحطام D. بعد ذلك ، يحتوي A-D-M-E-M-F 12 على BFDF و DGF للعينات. أكلها Tritrate بماصة سعة مليلتر واحد.

ثم احصل على تعليق الخلية المفردة باستخدام مصفاة الخلية. ضع الخلايا في القوارير بمعدل 20،000 إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر. ثم قم بإجراء تغيير متوسط كامل كل ثلاثة أيام ، والذي يتضمن الطرد المركزي للخلايا عند 1 ، 300 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

التخلص من Resus ، وتعليق PT في وسط جديد ، وإعادة الخلايا إلى قارورة الخلايا كل ستة أيام بعد خمس أيام على الأقل. انقل المجالات العصبية إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي سعة 15 مليلتر بسرعة 1,500 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تجاهل الاستلقاء.

أعد تعليق الحبيبات في الرحلات في EDTA لإنتاج معلق خلية واحدة. قبل إجراء عد الخلايا ، قم بإعداد مليلتر واحد من المعلق يحتوي على 10 ، 000 خلية. بعد ذلك ، قم بإزالة اللامينين من الزجاج جيدا واتركه حتى يجف تماما.

استبدله بملليلتر واحد من تعليق الخلية. بعد ذلك ، ضع الطبق في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح بالمرفقات. بمجرد أن تصبح الخلايا متجانسة بدرجة كافية ، قم بإزالة الوسيط من الغرفة.

قم بإزالة الزجاج بعناية. حسنا ، قم بتشكيل سقف فوق الخلايا عن طريق ربط الأوتوكلاف بعناية 22 × 22 ملم غطاء زجاجي بين شرائط 2 22 × 11 ملم بشحم السيليكون. تذكر أن تغطي الخلايا ببضع قطرات من الوسط لتجنب الجفاف.

ثم قم بتشكيل خزان متوسط معزول في كل طرف من طرفي الغرفة عن طريق إنشاء حاجز شحوم سيليكون مانع لتسرب الماء يمتد من أحد طرفي الطبق إلى الطرف الآخر. املأ الغرفة بوسط جديد ، مما يضمن التدفق من خزان متوسط إلى آخر. بعد ذلك ، أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة للسماح باستعادة الخلايا.

في الخطوة التالية ، قم بإعداد غطاء لتغطية الطبق عن طريق حفر فتحتين ، أحدهما موضوعة فوق كل خزان من غرفة الهجرة. ثم استبدل الوسط الموجود في الغرفة بوسط مزروع يحتوي على 25 ملم من الهيبيز عازلة. بعد ذلك ، انقل الطبق إلى نظام التصوير الذي يتم التحكم في درجة حرارته.

قم بتعيين المعلمات التجريبية للفاصل الزمني والتسجيل متعدد المواضع. قم بمحاذاة الغرفة بحيث يكون الكاثود والأنود على اليسار واليمين على التوالي للتأكد من أن متجه المجال الكهربائي يعمل أفقيا كما هو موضح تحت المجهر ومسجل في نظام التصوير. بعد ذلك ، املأ كوبسين.

مع حل شتاينبرغ. قم بتوصيل دورق منفصل بكل خزان متوسط باستخدام الجسور الزجاجية المعدة مسبقا والمملوءة بمحلول أجار 2٪ من شتاينبرغ. ثم ضع الأقطاب الكهربائية الفضية المتصلة بمصدر طاقة تيار مستمر في محلول شتاينبرغ.

في كل دورق ، اضبط قرص الجهد على مصدر الطاقة على الصفر وقم بتشغيله. قم بقياس الجهد عبر غرفة التكتيك الكهربائي باستخدام مقياس الجهد أثناء تشغيل قرص الجهد. ثم اضبط الجهد ليناسب المتطلبات التجريبية.

بعد ذلك ، ابدأ التسجيل بفاصل زمني. قم بإجراء تغيير متوسط وإعادة ضبط الجهد كما هو مطلوب. كل ساعة ، يمكن إضافة أدوية طازجة أو متوسطة أو عوامل كيميائية إلى الخزانات حسب الحاجة.

باستخدام ثقوب إضافية محفورة في غطاء طبق الاستزراع ، واحدة تقع فوق كل خزان متوسط. في هذه الخطوة ، قم بتشريح الحبل الشوكي القطني للفئران البالغة من العمر أسبوعين. ثم قم بتقطيع الحبل الشوكي إلى أقسام بسمك 500 ميكرون باستخدام مفرمة أنسجة ماشيل تتلاشى تحت المجهر التشريحي.

افصل الشرائح وحدد الشرائح ذات البنية الحبلية الشوكية المحورية السهمية السليمة. بعد ذلك ، ضع الشرائح في طبق بتري مقاس 100 ملم يحتوي على 30 ميكرولتر من هلام MA. ضعهم بالقرب من المركز قدر الإمكان.

احتفظ بها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. لكي يتم تجميع بروتينات ماتري هلام ذاتيا ، لإنتاج طبقة رقيقة تغطي سطح شرائح الحبل الشوكي ، من المهم جدا أن يتم تجميع جل ماتري بالكامل. احتضن طبق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إذا لزم الأمر ، ثم أضف أربعة إلى ستة ملليلتر من وسط D-M-E-M-F 12 الذي يحتوي على 25 ملليمولار HEIS ، و 15 إلى 20٪ مصل عجل الجنين.

برفق شديد لتجنب التدفق المتوسط مباشرة على الشرائح ، تأكد من عدم غمر الشرائح بالكامل في وسط ، مما يترك سطح الباذنجان معرضا جيدا للهواء. قم بتغيير الوسيط مرتين أسبوعيا. الآن احتضان تعليق الخلية السلفية العصبية في الوسط بخمسة خطافات ميكرومولار.

3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 2 لمدة 30 دقيقة. تحت المجهر ، استخدم أنبوبا زجاجيا شعريا لحقن ميكرولترين من المعلق في شريحة الحبل الشوكي. تأكد ببطء من أن الأنبوب الزجاجي الشعري يمر عبر matrigel ويصل إلى دواخل شريحة الحبل الشوكي.

احتفظ بالأنبوب الزجاجي داخل شريحة الحبل النخاعي لمدة 30 ثانية على الأقل لتجنب تعليق الخلايا. قم بالركض ، ثم ضع طبق بتري الذي يحتوي على شريحة الحبل الشوكي في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5 سنتات من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي ، قم ببناء غرفة تكتيك كهربائي حول شريحة الحبل الشوكي تحتوي على خطافات 3 3 3 4 2 خلايا تكوين الخلايا العصبية المسمى قبل تطبيق مجال كهربائي بقياس 500 مللي فولت لكل ملليمتر.

هنا تظهر الخلايا السلفية العصبية هجرة موجهة للغاية نحو الكاثود عند تعرضها للمجالات الكهربائية ، وتمثل الخطوط الحمراء والأسهم الزرقاء مسارات واتجاه حركة الخلية على التوالي. وهنا مؤامرة مسارات الهجرة المعروضة. فيما يلي الخلايا السلفية العصبية المسماة بخطافات 3 3 ، 3 ، 4 2.

تم زرعها في شريحة الحبل الشوكي العضوية عند نقطة بداية العلاج بالمجال الكهربائي. بعد أن هاجرت الخلايا السلفية العصبية اتجاهيا نحو الكاثود لمدة 2.5 ساعة ، انعكست قطبية المجال الكهربائي. أدت قطبية المجال الكهربائي المتغيرة إلى انعكاس حاد للمحور نحو الكاثود الجديد.

فيما يلي صورة للخلايا السلفية العصبية المزروعة داخل شريحة الحبل الشوكي. في نهاية تسجيل الفاصل الزمني وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا السلفية العصبية المزروعة داخل شريحة الحبل الشوكي تظهر هنا. إتقنة الكتلة.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد تطويرها. تمهد هذه التقنية الآن الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف هجرة الخلايا السلوبية العصبية في أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد استجابة وتطبيقها على المجال الكهربائي.