حيوية قبل المشبكي الدوبامين في الدماغ العقدة المخططة مع شرائح Voltammetry دائرى سريع التفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح بروتوكول عام للمسح السريع لشرائح القياس البعيد لـ V الدوري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير أنسجة الدماغ للتقطيع الإكليلي، ثم يتم وضع الأقطاب الكهربائية على المنطقة المحددة من الدماغ محل الاهتمام.

تتمثل الخطوة التالية في تسليط جهد كهربائي على شكل موجة مثلثية عبر القطب الكهربائي للكشف عن الدوبامين. وأخيراً، يتم تطبيق عامل دوائي مستهدف على شريحة الدماغ ومراقبة تأثيره على ديناميكيات الدوبامين قبل التشابكية. وفي نهاية المطاف، يوضح هذا البروتوكول التغيرات في ديناميكيات الدوبامين قبل التشابكية، مثل تحفيز إفراز الدوبامين ومعدلات استيعابه عبر قياس الفولتية الحلقي سريع المسح.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول ديناميكيات الدوبامين قبل التشابكية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، بما في ذلك حيوانات ونواقل عصبية أخرى، مثل الجرذان وذباب الفاكهة، والسيروتونين والنورإبينفرين على التوالي؛ حيث سيقوم فرانسيس مينا، وMEA خالد، وإيرين أو، طلاب الدراسات العليا في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. لبدء هذا الإجراء، ووفقاً للمخطوطة المرفقة، يتم تحضير ثلاثة أنواع من محاليل السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي: محلول السكروز A-C-S-F-A-C-S-F للتسجيلات الفولتمترية، ومحلول A CSF المعدل لمعايرة القطب الكهربائي. بعد ذلك، يتم نقل 10 milliliters من محلول السكروز A CSF إلى دورق صغير ووضعه في دلو ثلج. ثم يوضع لاصق Loctite الفوري في دلو الثلج.

بعد ذلك، قم بتجهيز شفرة حلاقة والأدوات اللازمة للتشريح، مثل الملاقط والملعقة والمقص، عن طريق مسحها بمسحة كحولية. ثم قم بالتضحية بالفأر عن طريق قطع الرأس واستخرج الدماغ بسرعة. ضع الدماغ في دورق يحتوي على محلول سكروز مبرد بالثلج، A CSF لمدة 10 دقائق تقريباً.

في هذه الأثناء، قم بتجهيز جهاز VIBRAM للتقطيع. ضع بعض الثلج المجروش في حمام العينات. ثم ضع حجرة العينة في جهاز Vibram وثبتها بإحكام.

أضف المزيد من الثلج حول غرفة العينة لملء الفراغات، وتأكد من عدم دخول أي ثلج إلى داخل الغرفة. بعد ذلك، ضع شفرة حلاقة نظيفة في حامل الشفرات. ثم املأ غرفة العينة بسائل sucrose A CSF مبرد بالثلج.

بعد ذلك، صب كمية من سائل sucrose A CSF البارد على قطعة من المناديل الورقية موضوعة فوق طبق بتري مقلوب. انقل دماغ الفأر الذي تم تشريحه حديثاً إليها باستخدام ملقط. ثم قم بإزالة المخيخ عن طريق القطع على طول المحور الإنسي الجانبي باستخدام شفرة حلاقة.

يؤدي ذلك إلى تكوين قاعدة مسطحة يمكن تثبيتها على منصة الاهتزاز. بعد ذلك، أضف قطرة من لاصق Loctite على منصة العينة. قم بتثبيت الطرف المسطح للدماغ المُجهز على المنصة فوراً، وحافظ على وضعيته قائمة قدر الإمكان.

بعد ذلك، ضع المنصة في غرفة العينة وأحكم ربط المسمار. تأكد من غمر الدماغ تماماً في sucrose A CSF داخل الغرفة. بعد ذلك، اضبط المنصة باستخدام أداة التحكم بحيث تتماشى شفرة الحلاقة مع الجزء العلوي من الدماغ.

يتم الحصول على المعلمات المثالية للهزاز عن طريق ضبط التردد والسرعة على المستوى المنخفض. بعد ذلك، يتم ضبط سمك الشريحة على 400 micrometers. وعادةً لا تحتوي الشرائح القليلة الأولى على الجسم المخطط.

كرر عملية التقطيع حتى يتم الحصول على الشرائح التي تحتوي على المخطط. وبمجرد الوصول إلى منطقة stri AAL، استخدم فرشاة رسم لرفع الشريحة ووضعها في دورق يحتوي على CSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة.

عادةً، يمكن الحصول على ثلاث إلى أربع شرائح تحتوي على المعقد المخطط (striatal complex) بحيث تشمل النواة المذنبة والputamen والنواة المتكئة. اترك الشرائح لتتأقلم في A CSF مع فقاعات من 95%O2 5%CO2 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في التجربة. لبدء هذا الإجراء، قم بتوصيل الأنابيب بغرفة التسجيل المغمورة.

بعد ذلك، يتم ضخ A CSF المؤكسج في درجة حرارة الغرفة بمعدل 1 mL/min. يتم ضبط متحكم درجة الحرارة على 32 °C بعد أن يملأ A CSF حامل الشرائح المصمم خصيصاً. ثم تتم إزالة أي فقاعات هواء من تحت الشبكة باستخدام سرنجة إبرية.

قم بتوليد ضغط سلبي في أنابيب التصريف باستخدام حقنة لبدء التدفق من أجل التحكم في فائض المحلول المنظم. ضع منديل كيم (Kim wipe) على حافة حامل الشريحة ليعمل كفتيلة. ثم انقل شريحة إلى حامل الشريحة في غرفة التسجيل، والتي يتم ترويتها باستمرار بسائل CSF مؤكسج في درجة حرارة الغرفة.

اغمر قطب الفضة/كلوريد الفضة المرجعي في حامل الشريحة وقم بتوصيله بمرحلة الرأس باستخدام مشبك تمساح. ثبّت القطب الكهربائي الدقيق من ألياف الكربون في الملاعب الدقيق وقم بتوصيله بمرحلة الرأس باستخدام مشبك تمساح. بعد ذلك، قم بخفض قطب التحفيز التنجستني والقطب الكهربائي الدقيق من ألياف الكربون حتى يصلا إلى سطح شريحة دماغ السلمون.

سيتم استخدام القطب المحفز لإيصال نبضة واحدة أو نبضات متعددة من التحفيز الكهربائي إلى الشريحة لاستثارة إطلاق الناقل العصبي، وذلك لقياس الدوبامين المستثار كهربائياً باستخدام قياس الفولتية الحلقي سريع المسح أو FSCV، حيث يتم تطبيق جهد بشكل موجة مثلثية على القطب. يتم تثبيت جهد القطب الدقيق المصنوع من ألياف الكربون عند -0.4 فولت، ثم رفعه تدريجياً وصولاً إلى الحد الموجب البالغ 1.2 فولت.

ثم قم بخفض الجهد مرة أخرى إلى -0.4 فولت بمعدل مسح قدره 400 فولت في الثانية. قم بتحفيز الشريحة كل خمس دقائق وقم بإجراء القياس الحجمي لـ dopamine FLX الناتج لمدة 15 ثانية في كل مرة، وذلك بعد الحصول على ثلاث تسجيلات على الأقل لإفراز الدوبامين المستقر الناتج عن التحفيز الكهربائي، والتي تُعرف بأن الفرق بين ارتفاعات القمم فيها أقل من 10%.

انتقل إلى تروية الشريحة بسائل CSF يحتوي على العامل الدوائي المطلوب بمعدل تدفق قدره 1 mL/min لمدة 30 دقيقة لتحقيق أقصى تأثير مشابه لتسجيل خط الأساس. قم بقياس إطلاق الدوبامين المحفز كهربائيًا كل خمس دقائق أثناء التروية الدوائية. يمثل الشكل A مثالاً لقياس إطلاق الدوبامين المستحث كهربائيًا باستخدام تقنية FSCV، وذلك بعد تحفيز بنبضة واحدة في النواة المذنبة والبطانة.

يوضح الشكل B مخططاً ثلاثي الأبعاد بالألوان الزائفة يدمج المعلومات المستخلصة من كل من مخططات التيار مقابل الزمن ومخطط الفولتاميتري الحلقي. وبالمثل، يوضح الشكلان A و C تحرر الدوبامين الناتج عن نبضة تحفيز كهربائي واحدة في نواة الأكومبانس (القشرة والقشرة الخارجية) على التوالي، كما تظهر المخططات ثلاثية الأبعاد بالألوان الزائفة لنواة الأكومبانس (القشرة والقشرة الخارجية) في الشكلين B و D على التوالي. وتظهر هنا المخططات التمثيلية بعد معالجة الشريحة بعامل دوائي لمدة 30 دقيقة، تلتها نبضات تحفيز أحادية لتحفيز تحرر الدوبامين في النواة المخططة (المنطقة المذيلة والبطامة).

العوامل المستخدمة في التجارب هي كينول، وميثامفيتامين، والعامل العصبي المشتق من الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح دماغية إكليلية للفئران للحصول على ديناميكيات الدوبامين قبل التشابكية وقياسها باستخدام تقنيتي fast و likely will telemetry.