حيوية قبل المشبكي الدوبامين في الدماغ العقدة المخططة مع شرائح Voltammetry دائرى سريع التفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح بروتوكول عام للمسح السريع للشرائح عن بعد الدوري V. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير أنسجة المخ أولا للتقطيع الإكليلي. ثم يتم وضع الأقطاب الكهربائية على منطقة الدماغ المنفصلة ذات الاهتمام.

الخطوة التالية هي توصيل الجهد كشكل موجة مثلثة عبر القطب الكهربائي للكشف عن الدوبامين. أخيرا ، يتم تطبيق عامل دوائي ذي أهمية على شريحة الدماغ ويلاحظ تأثيره على ديناميكيات الدوبامين قبل المشبكي. في النهاية ، يظهر هذا البروتوكول التغييرات في ديناميكيات الدوبامين قبل المشبكي ، مثل إطلاق الدوبامين المحفز ومعدلات امتصاص الدوبامين من خلال المسح الدوري السريع للقياس عن بعد.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لديناميكيات الدوبامين قبل المشبكي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، بما في ذلك الناقلات الحيوانية والعصبية ، مثل الفئران وذباب الفاكهة ، والسيروتونين والنورادرينالين الذي يوضح بشكل محترم أن الإجراء سيكون فرانسيس مينا ، والشرق الأوسط وشمال إفريقيا خالد ، وإيرين أو ، طلاب الدراسات العليا من مختبري لبدء هذا الإجراء ، وفقا للمخطوطة المصاحبة ، قم بإعداد ثلاثة أنواع من محاليل السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي ، والسكروز ، ومحلول A-C-S-F-F-A-C-S-F لتسجيلات Volta المترية وحل السائل الدماغي النخاعي المعدل لمعايرة القطب الكهربائي. بعد ذلك ، انقل 10 مل من السكروز A السائل الدماغي النخاعي إلى دورق صغير وضعه في دلو ثلج. ثم ضع لاصق Loctite الفوري في دلو ثلج.

بعد ذلك ، قم بإعداد شفرة حلاقة والأدوات اللازمة للتشريح ، مثل الملقط والملعقة والمقص عن طريق مسحها بقطعة كحول. ثم ضحي بالفأر بقطع الرأس وإزالة دماغه بسرعة. ضع الدماغ في دورق من السكروز المثلج ، السائل الدماغي النخاعي لمدة 10 دقائق تقريبا.

في غضون ذلك ، قم بإعداد VIBRAM للتقطيع. ضع بعض الثلج المجروش في حمام العينة. ثم ضع حجرة العينة في Vibram وثبتها بإحكام.

أضف المزيد من الثلج حول غرفة العينة لملء الفجوات وتأكد من عدم دخول الجليد إلى الغرفة. بعد ذلك ، ضع شفرة حلاقة نظيفة في حامل الشفرة. ثم املأ غرفة العينة بالسكروز المثلج A CSF.

بعد ذلك ، صب بعض السكروز البارد السائل النخاعي على قطعة من المناديل الورقية على طبق بتري مقلوب. انقل دماغ الفأر الذي تم تشريحه حديثا إليه باستخدام زوج من الملقط. ثم قم بإزالة المخيخ عن طريق القطع على طول المحور الجانبي الإنسي بشفرة حلاقة.

هذا يخلق قاعدة مسطحة يمكن تثبيتها على مرحلة الاهتزاز. بعد ذلك ، أضف قطرة من لاصق Loctite في مرحلة العينة. قم بلصق الطرف المسطح للدماغ المعد على المسرح على الفور ، واحتفظ به في وضع مستقيم قدر الإمكان.

ثم ضع المسرح في غرفة العينة وشد المسمار. تأكد من أن الدماغ مغمور تماما في السكروز A السائل الدماغي النخاعي في الغرفة. بعد ذلك ، اضبط المرحلة باستخدام عنصر التحكم بحيث تصطف شفرة الحلاقة مع الجزء العلوي من الدماغ.

يتم الحصول على المعلمات المثلى للهزاز عن طريق ضبط التردد والسرعة على مستوى منخفض. بعد ذلك ، اضبط سمك الشريحة على 400 ميكرومتر. عادة لا تحتوي الشرائح القليلة الأولى على المخطط.

كرر التقطيع حتى يتم الحصول على الشرائح التي تحتوي على المخطط. بمجرد الوصول إلى منطقة stri AAL ، استخدم فرشاة الرسم لرفع الشريحة ووضعها في دورق بدرجة حرارة الغرفة المؤكسجة. السائل الدماغي النخاعي.

عادة ، يمكن للمرء الحصول على ثلاث إلى أربع شرائح تحتوي علىمركب المذنبة الذي يتم فيه تضمين البوتامين المذنبة والنواة المتكئة. اسمح للشرائح بالتأقلم في السائل الدماغي النخاعي ، حيث تغلي مع 95٪ O2 5٪ CO2 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل متابعة التجربة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتوصيل الأنبوب بغرفة تسجيل الغمر.

ثم ضخ درجة حرارة الغرفة المؤكسجة A CSF بمعدل مليلتر واحد في الدقيقة. اضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة على 32 درجة مئوية بعد أن يملأ السائل الدماغي النخاعي حامل الشريحة المصمم خصيصا. قم بإزالة أي فقاعات هواء تحت الشبكة باستخدام حقنة إبرة.

قم بإنشاء ضغط سلبي في أنبوب التدفق الخارج باستخدام حقنة من أجل بدء التدفق للتحكم في فيضان المخزن المؤقت. ضع منديل كيم على حافة حامل الشرائح ليكون بمثابة فتيل. ثم انقل شريحة إلى حامل الشريحة في غرفة التسجيل ، والتي يتم تقويها باستمرار مع السائل الدماغي النخاعي المؤكسج في درجة حرارة الغرفة.

اغمر القطب المرجعي لكلوريد الفضة في حامل الشريحة وقم بتوصيله بمرحلة الرأس بمشبك التمساح. قم بتوصيل القطب الصغير المصنوع من ألياف الكربون بالمناور الصغير وقم بتوصيله بمرحلة الرأس بمشبك التمساح. بعد ذلك ، قم بخفض القطب المحفز للتنغستن والقطب الصغير المصنوع من ألياف الكربون على سطح شريحة الدماغ sal.

سيتم استخدام القطب المحفز لتوصيل نبضة واحدة أو نبضات متعددة من المحفزات الكهربائية إلى الشريحة لاستحضار إطلاق الناقل العصبي لقياس الدوبامين المستحث كهربائيا باستخدام المسح السريع للقياس عن بعد الدوري أو FSCV ، وتطبيق الجهد في شكل موجة مثلثة على القطب. احتفظ بإمكانات القطب الصغير المصنوع من ألياف الكربون عند سالب 0.4 فولت. قم بتكثيفه إلى حد موجب يبلغ 1.2 فولت.

ثم قم بإعادته إلى سالب 0.4 فولت بمعدل مسح 400 فولت في الثانية. قم بتحفيز الشريحة كل خمس دقائق وقم بإجراء قياس مقياس الحجم للدوبامين الناتج FLX لمدة 15 ثانية في كل مرة بعد ثلاث دقائق على الأقل. يتم تعريف تسجيلات إطلاق الدوبامين المستقرة المحفزة كهربائيا على أنها أقل من 10٪ فرق بين ارتفاعات الذروة.

قم بالتبديل إلى حشو الشريحة باستخدام عامل دوائي يحتوي على السائل الدماغي النخاعي بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة للحصول على أقصى تأثير مشابه لسجل التسجيل الأساسي. إطلاق الدوبامين المحفز كهربائيا كل خمس دقائق أثناء التروية الدوائية. الشكل أ هو مثال على قياس إطلاق الدوبامين المستحث كهربائيا باستخدام FSCV ، بعد تحفيز نبضة واحدة في بوتامين المذنبة.

يوضح الشكل ب مخططا ثلاثي الأبعاد للألوان الزائفة يجمع بين المعلومات من كل من آثار التيار مقابل الوقت والفولت الدوري جراهام. وبالمثل ، يوضح الشكلان A و C إطلاق الدوبامين الذي يتم استثارته بواسطة نبضة تحفيز كهربائي واحدة في نواة المتكئة والقشرة على التوالي ، ويشار إلى مخططات الألوان الزائفة ثلاثية الأبعاد لنواة المتكئة والقشرة في الشكلين B و D على التوالي. تظهر هنا الآثار التمثيلية بعد معالجة الشريحة بعامل دوائي لمدة 30 دقيقة ، متبوعة بتحفيز نبض واحد لاستحضار إفراز الدوبامين في البوتامين المذنب.

العوامل المستخدمة في التجارب هي الكينول والميثامفيتامين وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح الدماغ الإكليلية للفأر للحصول على ديناميكيات الدوبامين قبل المشبكي وقياسها باستخدام القياس عن بعد السريع ومن المحتمل أن يكون كذلك.