كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور نقص الأكسجة في الأنسجة الإقليمية الدقيقة مباشرة في قشرة الفأر في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد نافذة جمجمة مفتوحة أولا في فأر مخدر. بعد ذلك ، يتم حقن صبغة الفلورسنت عن طريق الوريد لتسمية الأوعية الدموية الدماغية.

أخيرا ، يتم إجراء تصوير الفوتون لمضان NADH الجوهري والأوعية الدموية الدقيقة القشرية المسماة بالفلورسنت. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر نقص الأكسجة الوظيفي في المناطق الدقيقة من حمة الدماغ من خلال تصور وجود الشكل المخفض من النيكوتيناميد ، ثنائي نوكليوتيد الأدينين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل أقطاب كلارك هي أنها تعطي دقة خاصة عالية على مجال الرؤية الكبير ، كما أنها أقل توغلا.

يمكن إجراء هذه الطريقة على نظام صور قياسي مطبق مع قناتين فلوريتين. مرحبا ، أنا ستيف هيرست ، أستاذ ورئيس علم الأحياء الدقيقة والمناعة في جامعة روتشستر ، أظهر أن الإجراء اليوم سيكون ابن أنيتا من مختبر كيشكا ، بالإضافة إلى أوكسانا بولكا ، أستاذ مساعد باحث من مختبري ، الدكتور كيشكا ، الذي كان رائدا في تقنية تصوير NADH ، لا يمكن أن يكون هنا اليوم لأنه انتقل مؤخرا إلى ألمانيا. بعد تجهيز موقع الجراحة بالأدوات اللازمة التي تم تعقيمها أو تطهيرها ب 70٪ من الإيثانول وتم تخدير الفأر بنسبة 5٪ من الفلور ، ضعه على وسادة تسخين ووضع قناع للوجه لتوصيل 1.3 إلى 1.5٪ من الفلور في الهواء.

تحقق من مستوى التخدير عن طريق إجراء قرصة الذيل. بعد ذلك ، أدخل مسبارا مستقيميا وقم بقياس درجة حرارة جسم باستمرار طوال العملية. ضع جل المسيل للدموع الاصطناعي على عيون الفأر لمنعها من الجفاف.

ثم قم بإزالة الشعر من الرأس وكلا الفخذين يضع مزيل الشعر على الفخذ لمدة دقيقتين لإزالة الشعر المتبقي ، وسيتم استخدام الفخذ لقياس التأكسج. أخيرا ، قم بتطهير فروة الرأس باستخدام محلول اليود بوفيدون بنسبة 10٪ و 70٪ من الإيثانول. لجعل نافذة الجمجمة تبدأ خمسة ملليمترات مدللة إلى الجمجمة مع مقص.

قم بعمل شق في فروة الرأس وتقدم سنتيمترا واحدا. حرك الجلد إلى الجانبين لكشف الجمجمة لإزالة الأغشية الموجودة أعلى الجمجمة. ضع محلول كلوريد الحديديك بنسبة 10٪.

امسح المحلول الزائد واكشط الأغشية بزاوية 45 درجة. رقم خمسة ، ملاقط باستخدام مجهر تشريح ، حدد مجال الاهتمام. ضع طبقة رقيقة من الغراء السريع حول حواف نافذة لوحة الرأس.

ضع لوحة الرأس بحيث تتعرض منطقة الاهتمام في النافذة وقم بالضغط الخفيف على لوحة الرأس. ضع كمية صغيرة من أسمنت الأسنان لبلمرة الغراء بسرعة. استمر لمدة 10 ثوان أثناء بلمرة الغراء.

ضع كمية صغيرة من الغراء السريع على حواف النافذة لإغلاق لوحة الرأس والجمجمة. ثم قم بربط لوحة الرأس بحامل تحت نطاق التشريح. باستخدام عزم الدوران الصغير اثنين من مجموعة الحفر عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة و IRF 0 0 5 مثقاب.

قم بإزالة كل الغراء الإضافي من الجمجمة ومن لوحة الرأس. ثم اضبط المثقاب على ألف دورة في الدقيقة وابدأ في حفر الجمجمة عن طريق عمل دائرة داخل نافذة لوحة الرأس بقطر حوالي خمسة ملليمترات. استخدم حركات كاسحة خفيفة كما لو كنت ترسم بقلم رصاص ناعم جدا.

توقف عن الحفر كل 20 إلى 30 ثانية واستخدم الهواء المضغوط لإزالة غبار العظام. مع تقدم الحفر ، يتشكل جحر حول الجمجمة السليمة في المركز. احرص على عدم اختراق الجمجمة الرقيقة ، ولكن تأكد من أن هذا الجحر ذو سمك متساو.

بالإضافة إلى ذلك ، كن حذرا للغاية حول الأوعية الدموية الكبيرة. لا ينبغي المساومة عليها ، وإذا أمكن ، حتى لا يتم لمسها بشق واحد من الملقط ، ارفع العظم في وسط النافذة وقم بتطبيق قطرة من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي على النافذة. باستخدام زاوية منديل كيم ، امسح السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي برفق باستخدام زاوية 45 درجة.

رقم خمسة ، ملاقط. حدد موقع منطقة من الجافية التالفة على طول حافة النافذة وارفعها لإزالتها. في حالة حدوث نزيف ، ضع قطرة من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي وانتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتوقف النزيف الطفيف.

بعد ذلك ، قم بإعداد 10 مل من 0.07٪ منخفض الذوبان الهوائي المذاب في السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي. اجلب الأقواء الذائبة إلى درجة حرارة الجسم. امسح السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي الزائد من سطح الدماغ.

صب aeros في النافذة وقم بتغطيتها بشريحة زجاجية. ثم اضغط على الزجاج برفق للتلامس بين الزجاج ولوحة الرأس وانتظر لمدة 10 إلى 20 ثانية حتى يصبح الهواء صلبا. باستخدام ملاقط ومناديل ورقية ناعمة ، قم بإزالة الهواء الزائد من الغطاء الزجاجي.

ضع كمية صغيرة من الغراء السريع حول الزجاج لصقه على لوحة الرأس. ثم ضع كمية صغيرة من أسمنت الأسنان لترسيخ الغراء للحقن في الوريد الفخذي. اقلب جزئيا لفضح الجزء الداخلي من الفخذ الأيسر.

استخدم الشريط اللاصق لتأمين. في هذا الوضع ، ضع مقشرا مطهرا ، ثم مائة بالمائة من الإيثانول على الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق على طول الفخذ الإنسي من الركبة إلى تخليق العانة.

إذا لزم الأمر ، افصل الأنسجة الرخوة عن طريق التشريح الحاد. املأ حقنة سعة مليلتر واحد ب 130 ميكرولتر من تكساس الأحمر. قم بتوصيل إبرة جديدة بقياس 30 وثنيها بعناية بزاوية 30 درجة ، مع الحفاظ على الشطبة لأعلى.

املأ الإبرة بمحلول تكساس الأحمر تحت مجهر تشريح ، وأدخل الإبرة في الوريد الفخذي وحقن مائة ميكرولتر من تكساس الأحمر. قم بإزالة الإبرة واضغط برفق على الوريد بشاش لوقف النزيف. أغلق الجلد باستخدام خياطة أربعة أوه للمراقبة المستمرة لتشبع الأكسجين في الدم.

ضع مسبار مقياس التأكسج على الفخذ الأيمن الذي تمت إزالة الشعر منه مسبقا. لبدء التصوير ، انقل الفأر المعد جراحيا إلى مرحلة المجهر. التقط صورة أولية لموقع نافذة الجمجمة باستخدام إضاءة المجال الساطع بتكبير أربعة × لاستخدامها كخريطة مرجعية للتسجيل بتكبير أعلى إلى أنيات الفوتون.

قم بتكبير منطقة الاهتمام باستخدام تكبير 10 ×. حدد مجال الاهتمام في الطبقات القشرية. يبدأ واحد أو اثنان في تسجيل السلسلة الزمنية.

نوصي باستخدام ما معدله ثلاثة إلى خمسة إطارات لزيادة جودة الصورة. بعد ذلك ، قم بتحفيز نقص الأكسجة في الدم عن طريق إضافة 50٪ من النيتروجين إلى الهواء الذي يتنفسه. سيؤدي ذلك إلى رفع مستوى الأكسجين إلى 10٪ تحقق من نقص الأكسجة في الدم من خلال مراقبة بيانات مقياس التأكسج.

استمر في تسجيل السلسلة الزمنية من خلال نقص الأكسجة في الدم لمدة 30 ثانية تقريبا وبعد استعادة مستوى الأكسجين الطبيعي. جمع البيانات لحساب توزيع الأكسجين عن طريق اكتشاف وقياس وقياس منطقة نقص الأكسجة وأسطوانات الأنسجة المؤكسجة حول الأوعية الدموية. لتحديد نصف قطر أسطوانة أنسجة الصراخ R ، قم بقياس المسافة بين مركز الأوعية الدموية والحدود التي يتم عندها اكتشاف تألق NADH العالي.

ارجع إلى البروتوكول المكتوب لطرق معالجة البيانات. يوضح هذا الشكل صور جغرافية NADH متزامنة من الفيديو المسجل أثناء نقص الأكسجين العابر ، وتم تخفيض تركيز الأكسجين الملهم من 21٪ إلى 10٪ لمدة ثلاث دقائق. هذا المستوى من نقص الأكسجة الناجم عن التجربة كاف للحث على نقص الأكسجة الشديد في القشرة الدماغية.

أدى نقص الأكسجة إلى زيادة مضان NADH الموضح باللون الأخضر في البداية في المناطق الأبعد عن إمدادات الدم الشرياني. لاحظ أن حدود أنسجة NADH الحادة ، والتي تمثل حدود الأنسجة التي يمكن ملاحظتها لانتشار الأكسجين من دوران الأوعية الدقيقة القشرية الموضحة باللون الأحمر. فيما يلي صورة متزامنة للأوعية الدقيقة المصنفة فلورية للقشرة باللون الأحمر ، والتألق الجوهري NADH من المادة الرمادية للقشرة باللون الأخضر ، وتوزيع شدة مضان NADH ثنائي

هناك مناطق ذات مضان NADH منخفض بشكل موحد ومناطق ذات مضان NADH مرتفع بشكل موحد. تمثل الخطوط الصفراء حدود الأنسجة بين المناطق ذات التألق المنخفض والمرتفع NADH. تظهر حدود الأنسجة هذه علاقة مكانية مع الأوعية الدقيقة القريبة.

يتم تحديد هذه العلاقة عن طريق انتشار الأكسجين من الأوعية الدقيقة إلى الأنسجة. في بعض الحالات ، يمكن التعرف مباشرة على الطبيعة الأسطوانية أو أسطوانة أنسجة CRO لحدود الأنسجة هذه كما هو موضح في الخطوط الزرقاء. هنا ، حدود الأنسجة ذات شكل دائري مع وعاء دموي مركزي متحد المركز بمجرد إتقانه.

يمكن إجراء هذه التقنية في 1.5 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر لصق زجاج الغطاء على اللوح المعدني لمنع الحركة الرأسية للسطح القشري بسبب الوذمة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليلات إضافية مثل قياسات احتقان الدم الوظيفي بهدف معالجة أسئلة إضافية مثل العلاقة بين نقص الأكسجة في الأنسجة والاقتران الدماغي الوعائي

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور نقص الأكسجة في الأنسجة الإقليمية الدقيقة في قشرة الفأر.