شرح وظيفة الجينات النباتية عن طريق الجينوم المشترك، الايض والمعلوماتية

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف وتوصيف وظائف جينية جديدة باستخدام التعليق التوضيحي للجينات عبر التحليل المشترك لتنميط المستقلبات وتحليل التعبير المشترك. ويتم تحقيق ذلك من خلال مراعاة التصميم التجريبي مع التركيز على مسارات أيضية وأنواع نباتية محددة. وكخطوة ثانية، تُستخدم مناهج تحليلية لبناء المسار الأيضي الكامل بناءً على الهياكل الكيميائية للمركبات المكتشفة.

بعد ذلك، يتم دمج بنية المسار المتوقع مع تحليل التعبير المشترك لتضييق نطاق الجينات المرشحة، والتي تشير افتراضياً إلى الجينات الرئيسية في عملية التمثيل الغذائي. وفي النهاية، يتم الحصول على النتائج من خلال إجراء الحد الأدنى من التجارب مع الاستخدام الفعال لعدة موارد بيولوجية من أجل توصيف التحديد الوظيفي للجينات. لقد تبلورت لدينا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما وجدنا ارتباطاً عالياً جداً للجينات الكيسية الحيوية Abosi OID في قاعدة بيانات التعبير المشترك المسماة ate.

لقد اعتبرنا أن هذه الاستراتيجية تعد واحدة من أسرع الطرق للعثور على وظائف الجينات الجديدة باستخدام قواعد البيانات المتاحة للعموم والاستخدام الفعال للموارد الحيوية. لبدء عملية الاستخلاص، قم بحصاد المواد النباتية وتجميدها فوراً في النيتروجين السائل. وبمجرد تجميدها، قم بطحن المواد النباتية باستخدام مطحنة خلط، ثم وزع المادة النباتية المجمدة في أنابيب EOR سعة 2 مل، وأضف بعد ذلك كرة معدنية إلى الأنبوب.

أضف 250 µL من محلول استخلاص منظم لكل 50 mg من العينة. يحتوي محلول الاستخلاص المنظم على معيار داخلي لعملية التسوية. بعد ذلك، قم بتجانس المسحوق المجمد باستخدام مطحنة الخلط لمدة دقيقتين.

بتردد قدره 25، قم بطرد العينة مركزياً عند 12,000 RPM لمدة 10 دقائق. ثم انقل الراشح إلى مرشح طرد مركزي. وبعد إجراء جولة ثانية من الطرد المركزي، انقل الراشح إلى أنبوب einor جديد.

بعد ذلك، يتم إعداد جهاز HPLC من خلال التحقق أولاً من أن درجة حرارة فرن العمود هي 35 °C، وأن درجة حرارة صينية العينات هي 10 °C. ثم تُضبط شروط مطيافية الكتلة ويتم التحقق من حالة الفراغ والشعيرة الساخنة. وأخيراً، يتم إجراء معايرة الشحنة الزائدة للكتلة لكاشف MS عن طريق الحقن بالتسريب لمزيج محلول المعايرة.

استخدام تطبيق المعايرة التلقائية في البرنامج. ثم يتم نقل 50 µL من المستخلصات إلى قارورة زجاجية. وبالنسبة لتقنية HPLC، يتم إجراء خمس حقنات على الأقل من محلول استخلاص منظم قبل إجراء تحليل العينة الأولى وفقاً لما هو موضح في الإجراء المكتوب.

بعد تهيئة أداة تحليل مطيافية الكتلة، حدد البيانات المراد معالجتها. قم بإعداد جدول بالقمم المكتشفة ذات الأهمية وفقاً لفئة المركب الموضحة في البروتوكول المكتوب. حدد القمم من خلال التطور المشترك مع المركبات القياسية، وقم بتوصيف القمم المكتشفة باستخدام تحليل Ms.MS، والمراجع العلمية، والمسح، والبحث في قواعد بيانات المستقلبات في هذه الخطوة.

يجب أن يستند التنبؤ بالمسار إلى التراكيب الكيميائية من خلال ربط الوظيفة الإنزيمية في المسار الأيضي. لذا، يجب تنفيذ هذه الخطوات عبر التحديد الدقيق للقمم الخاصة بالمركبات المكتشفة. وتعد قواعد بيانات المسارات الأيضية العامة، مثل قاعدة بيانات keg وplant psych، فعالة للغاية في التنبؤ بالمسار الأيضي المطلوب.

لإعداد قائمة جينات تتضمن الجينات المتماثلة (orthologs) في نبات Arabidopsis، قم أولاً بتنزيل قائمة معرفات الجينات من قاعدة البيانات الجينومية. أضف معرف جين Arabidopsis للجينات المتماثلة في حال لم يكن النبات المستهدف هو Arabidopsis. ثم قم بإعداد قائمة بالجينات الموجودة في المسار الحيوي المراد دراسته.

تتوفر بيانات التعليق التوضيحي لمسارات Arabidopsis وبيانات عائلة الجينات على موقع TAAR. يمكن بعد ذلك دمج قوائم جينات Arabidopsis Orthologs. قم بإجراء تحليل شبكة التعبير المشترك باستخدام قائمة معرفات الجينات المُعدة للبحث في أفضل قاعدة بيانات للمسار المتوقع.

التحقق من الارتباط بين أزواج جينية معروفة في المسار قيد الدراسة. في حال عدم توفر قاعدة بيانات التعبير المشترك أو قاعدة بيانات التعبير الجيني، ينبغي استخدام قاعدة بيانات التعبير المشترك لـ Arabidopsis في المخطط المعني مع قائمة بالجينات المتماثلة لـ Arabidopsis.

بعد ذلك، قم بإنشاء إطار عمل لشبكة التعبير المشترك المستهدفة. وبناءً على ارتباطات الجينات المعروفة في المسار المختار، أضف الجينات المرشحة المرتبطة وتحقق من تعليقاتها الجينية في العائلات المتوقعة ضمن ارتباطات هذه الشبكة للعثور على أفضل مرشح.

يجب تنسيق قيمة عتبة معاملات الجينات وفقاً لبنية الشبكة وكثافة الجينات المرتبطة. قم الآن بإعداد قائمة بالجينات التي يمكن تقليصها لتكون متخصصة في المسار المستهدف. وباستخدام هذه القائمة، تحقق من التعبير الجيني لخصوصيات الأعضاء واستجابات الإجهاد للجينات المرشحة.

ابدأ في دمج المعلومات من خلال إضافة الجينات جيدة التوصيف التي استُخدمت في الاستعلام عن تحليل التعبير المشترك إلى المسار الأيضي المتوقع. أجرِ بحثاً في الدراسات السابقة للتحقق مما إذا كانت الأجزاء غير الموصوفة من هذا المسار جديدة، بما في ذلك الخطوات الإنزيمية غير الموصوفة، وبروتينات النقل، وعوامل النسخ. عند هذه النقطة، توقع التوسيم الجيني الأكثر ملاءمة لهذه الخطوات المفقودة غير الموصوفة.

الجمع بين نتائج توصيف المستقلبات والجينات المرشحة للتعبير الجيني الحاسوبي بناءً على المسار المتوقع. بعد ذلك، يتم ترتيب الجينات المرشحة على المسار المتوقع وفقاً لوظيفة الجين. على سبيل المثال، إنزيم acetyl transferase للمستقلبات المأسيتلة، وglycosyl transferase للجليكوسيدات، وP450 للمركبات المؤكسدة.

تحقق من اتساق خصوصيات الأنسجة أو استجابات الإجهاد بين تراكم المستقلبات ومستوى التعبير الجيني للجينات المرشحة. تحقق أيضاً من الارتباطات بعمليات الأيض الأخرى لتوفير الركيزة والجينات المستجيبة للإجهاد. وكخطوة نهائية، قم بإجراء تجربة لتحديد وظيفة الجين باستخدام الموارد الحيوية مثل مكتبة الطفرات المعطلة (knockout mutant library) ومكتبة cDNA كاملة الطول.

فيما يلي مثال على تحليل شبكة التنظيم المشترك لمسار الأنثوسيانين. تم إجراء تحليلات التعبير المشترك باستخدام مؤشر التعبير المشترك PRAM استناداً إلى مجموعة البيانات المضافة في الإصدار الثالث مع برنامج PX، حيث عُرضت كعقد حمراء؛ وقد استُخدمت 12 جيناً إنزيمياً للأنثوسيانين وعاملين من عوامل النسخ لإنتاج الأنثوسيانين للبحث عن الجينات المرشحة. تمت إعادة بناء شبكة تعبير مشترك تضم 68 جيناً مرشحاً مرتبطاً و14 جيناً استعلامياً، وذلك من خلال ترابط البحث عن المجموعات باستخدام قاعدة بيانات prime، مما أدى إلى إنتاج ملفات مخرجات T net التي رُسمت باستخدام برنامج PX.

تشير العقد الزرقاء إلى الجينات المرشحة التي ارتبطت بجينات الأنثوسيانين بعد تطورها. ستمنحنا هذه الاستراتيجية مؤشراً جيداً للتنبؤ بوظائف جينية جديدة في عمليات الأيض النباتية.