تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

الهدف من هذا الإجراء هو أن تكون قادرا على تحديد نسبة الخلايا في المراحل المختلفة لدورة الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة كاشف وضع العلامات على تكاثر الخلايا BRDU أولا إلى ثقافة خلية قابلة للحياة لدمجها في الحمض النووي المركب حديثا في البقعة التالية ، BRDU في الخلايا التي دمجت الكواشف ، ثم يتم تلطيخ الحمض النووي بيوديد البروبيديوم. الخطوة الأخيرة هي تقييم نسبة الخلايا في المراحل المختلفة لدورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي.

في نهاية المطاف ، يمكن تصور توزيع دورة الخلية لمجموعة من الخلايا التجريبية من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المسماة BRDU. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل دمج ثلاثي إلى زعتر وعد التلألؤ هي أنه مع وضع العلامات BRD ، يمكن تحديد نسبة الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. يعد العرض المرئي لهذه الرسالة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تفسير مجموعة التحليل الخلوي دون الصور المصاحبة للمعلمات المختلفة التي تحتاج إلى تعديل.

سيظهر الإجراء طالبان من طلاب الدراسات العليا من مختبري ، مات تشي وأنا ميري. أضف BRDU في تخفيف واحد إلى 1000 إلى مزارع الخلايا التجريبية تحتضن لمدة ساعة واحدة لحصاد الخلايا ، واستنشاق وسط الثقافة ، ثم غسل الخلايا جيدا باستخدام PBS مرتين لإزالة جميع آثار الوسط. هذه المرة باستخدام PBS المكمل بثلاثة مللي مولار EDTA ، اشطف الثقافات بسرعة مرة أخرى ، ثم استنشق محلول P-B-S-E-D-T-A جيدا لفصل الخلايا.

أضف حوالي 0.5 مل من P-B-S-E-D-T-A إلى كل طبق استزراع يبلغ طوله ستة سنتيمترات واحتضن الأطباق عند 22 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم انقل مزارع الخلايا من كل لوحة إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مل. الآن قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالة السوبينات ، ثم أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS.

أخيرا ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من 95٪ من الإيثانول بالتنقيط أثناء دوامة التنقيط للخلايا عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، قم بإزالة الإيثانول وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من اثنين من حمض الهيدروكلوريك العادي الذي يحتوي على 0.5٪ تريتون × 100 عن طريق إضافة المحلول إلى الخلايا بطريقة متساقطة أثناء الدوامة ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد تكوير الخلايا مرة أخرى ، استنشق المادة الطافية S مع إيلاء عناية خاصة لأن الخلايا تشكل حبيبات فضفاضة جدا في هذه الخطوة.

ثم أعد تعليق الحبيبات برفق في مليلتر واحد من معدل تجويف رباعي الصوديوم 0.1 مولار واحتضان الخلايا مرة أخرى. الآن قم بتكسير الخلايا مرة أخرى وهذه المرة احتضانها في 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة التي تحتوي على أجسام مضادة للفأر المضادة ل BRDU مخففة من واحد إلى 50 بعد تكوير الخلايا مرة أخرى. هذه الحبيبات في 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة التي تحتوي على أجسام مضادة ثانوية مترافقة مضادة للأرانب المضادة للولايات المتحدة ZI ، مخففة من واحد إلى 25.

ثم احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة من درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي لخلايا الوقت النهائي ، قم باحتضانها في 0.5 مل من يوديد البروبيديوم ومحلول الحمض النووي الريبي في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أخيرا ، قم بتمرير محلول الخلية المهضومة عبر مصفاة خلوية لإزالة الركام.

ثم انقل الخلايا المفردة إلى أنبوب مناسب لامتصاص العينة على مقياس التدفق الخلوي لتكاثر مجموعات الخلايا بشكل غير متزامن مثل تلك الموضحة. في هذا المثال ، ضع بوابة حول القمتين الأكثر وفرة في مخطط التمييز المزدوج لتحديد أحداث الخلية المفردة لجميع التحليلات اللاحقة. ثم قم بتحليل عينة ثقافة متكاثرة بشكل غير متزامن لتكون بمثابة تحكم إيجابي في إعداد معلمة التلوين ومقياس التدفق الخلوي.

اضبط حساسية أنبوب المضاعف الضوئي لتلوين يوديد البروبيديوم بحيث تتمركز قمتا N وأربعة N من الخلايا المفردة عند الوحدات التعسفية 200 و 400 على المحور x. بعد ذلك ، اضبط حساسية أنبوب مضاعف الصور لاكتشاف FXI بحيث تكون الخلايا السالبة ل FXI أعلى من مستويات الخلفية. يجب أن تكون الخلايا الموجبة BRDU أكثر سطوعا بحوالي 10 مرات ويجب عرض المحور x كمقياس لوغاريتمي.

تشكل الأحداث الفردية التي يتم التقاطها بواسطة مقياس التدفق الخلوي قوسا على شكل حدوة حصان من G المرحلة الأولى في أسفل اليسار إلى المرحلة S ثم تعود إلى أسفل اليمين لمرحلة G two M. كما هو موضح في هذا الشكل التمثيلي ، اجمع 5 ، 000 إلى 10، 000 حدث خلية واحدة لتحقيق النطاق المطلوب لمحتوى الحمض النووي. بعد قياس محتوى يوديد البروبيديوم و BRDU ، قم بتعيين الخلايا إلى مرحلة G واحد s أو G اثنين من MPH مع بوابات حول مجموعتين سالبين من BRDU متمركزة عند 200 ل G واحد و 400 ل G two M. ستمثل النسبة المئوية للخلايا في كل بوابة العدد النسبي للخلايا في مرحلتي G واحد s و G اثنين M كما هو موضح هنا في هذا الرسم البياني الشريطي لشكل المخطط المبعثر السابق.

بعد تلطيخ علامة الخلية ذات الأهمية في هذا المثال ، يقوم CD 20 بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق عند 22 درجة مئوية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS مكملة بنسبة 1٪ BSA. بعد تكوير الخلايا مرة أخرى عند 500 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة ، استخدم 0.5 مل من محلول يوديد البروبيديوم والحمض النووي الريبي لإعادة ترطيب الخلايا. ثم قم بتلطيخ الخلايا وهضمها كما هو موضح للتو الآن ، قم ببوابة قمم الخلية المفردة ذات النهاية الأربعة ، ثم اضبط حساسية أنبوب المضاعف الضوئي للكشف عن FXI بحيث تكون الخلايا غير الملوثة أعلى من مستويات الخلفية.

من الناحية المثالية ، ستكون الخلايا الموجبة CD 20 FXI ملطخة بشكل مكثف من 10 إلى 100 مرة من الخلفية. مرة أخرى ، يجب عرض المحور x كمقياس مقياس لوغاريتمي. أخيرا ، حدد الخلايا الموجبة CD 20 التي تكون أكثر إشراقا ب 10 مرات من مستويات الخلفية ومع تلطيخ يوديد البروبيديوم بين 200 و 400 للعرض في الرسم البياني ليوديد البروبيديوم مقابل الرسم البياني لعدد الخلايا كما هو موضح هنا في هذا الشكل ، اجمع ما لا يقل عن 1000 CD 20 حدثا إيجابيا لكل عينة للحد من التباين في هذا الشكل.

يتم عرض تحليل قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد لخلايا صبغة بروبيديوم يوديد وخلايا بقع BRDU. لاحظ أن الخلايا التي تحتوي على اثنين من محتوى n وأربعة NDNA تتمركز على علامتي 200 و 400 على مقياس المحور X. بالنسبة لكثافة تلطيخ يوديد البروبيديوم ، يتم قياس شدة تلطيخ BRDU على مقياس لوغاريتمي.

على المحور Y ، لاحظ مواضع البوابات المستخدمة لقياس الخلايا في مرحلتي G واحد و G و M من دورة الخلية. تظهر هنا النسبة النسبية للخلايا في كل من بوابات G one s و G اثنين M من الشكل السابق. هنا ، البروبيديوم واليوديد والقرص المضغوط 20.

تلطيخ من خليط من الخلايا ، بعضها يعبر عن CD 20 و PRB خارج الرحم. لاحظ أن الخلايا التي تحتوي على اثنين من n و أربعة NDNA ، وهي المجموعات الأكثر وفرة ، تتركز على 200 و 400 علامة على المحور x. موضع المشية الإيجابية CD 20 يحدد الخلايا الملطخة ب 10 مرات على الأقل أكثر سطوعا من الخلفية.

يمثل هذا الرسم البياني عدد الخلايا مقابل تلطيخ يوديد البروبيديوم للخلايا السالبة CD 20 من مخطط التشتت السابق التي تتكاثر بشكل غير متزامن في هذا الرسم البياني CD 20 الخلايا الموجبة من مخطط مبعثر CD 20 السابق الذي تم تحفيزه على التوقف مع تعبير p rrb وتحتوي على خلايا تحتوي بشكل أساسي على محتوى NDNA في المقام الأول. توضح هذه البيانات أنه يمكن تمييز مجموعة سكانية فرعية تم القبض عليها عن الخلايا الأخرى في الثقافة باستخدام تقنية التلوين هذه. في الأشكال الثلاثة التالية ، يتم عرض بيانات من تحليل قياس التدفق الخلوي للتعبير الفيروسي القهقري لمثبط كيناز المعتمد على Cyclin P 27 KIP واحد في الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

بروبيديوم يوديد ، تم استخدام تحليل BRDU لقياس مراحل دورة الخلية في مجموعة من الخلايا التي تتكاثر بشكل غير متزامن والتي تم نقلها مع ناقل فيروسي قهقري فارغ من فاتنة P كما هو موضح هنا. كان هناك عدد قليل من الأحداث الإيجابية ل BRDU واضحة في بوابة المرحلة S استجابة ل P 27. لاحظ أيضا الكثافة الأكبر للأحداث في البوابات G one و G two M.

وبالمثل ، فإن النسبة المئوية للخلايا في المرحلة S للخلايا التي تعبر عن P 27 منخفضة جدا كما هو موضح في هذا الشكل. كان هذا النوع من التحليل فعالا جدا في توصيف عجز التحكم في دورة الخلية في الخلايا المشتقة من سلالات مختلفة من الفئران المستهدفة بالجينات. في هذين الشكلين التاليين ، تم علاج الخلايا الظهارية للذاكرة غير المشكلة بالسيتوكين المثبط للنمو TGF beta واحد لمدة 24 ساعة.

كما هو موضح في هذا الشكل الأول ، فإن وضع العلامات على BRDU في خلايا المرحلة S يتضاءل بشكل كبير عن طريق إشارات TGF beta one. لاحظ تراكم الخلايا بشكل أساسي في مرحلة G المرحلة الأولى من دورة الخلية كما يتضح من اللوحة الوسطى. يؤكد القياس الكمي للمراحل المختلفة لدورة الخلية أن TGF beta one يمنع في المقام الأول التكاثر في G المرحلة الأولى من دورة الخلية مما يؤدي إلى تراكم في هذه المرحلة.

في هذه السلسلة الأخيرة من التحليل التجريبي ، نقص PRB ، تم نقل خليتين SAS باستخدام ناقل التعبير CMV CD 20 وإما CMV RB أو CMV beta GAL كعنصر تحكم. يوضح هذا الشكل الأول توزيع دورة الخلية للخلايا المنقولة للتحكم السلبي مقارنة بتوزيعها بعد 72 ساعة من تعبير PRB. لاحظ أن الوجود الحصري تقريبا لذروة اثنين من N في اللوحة اليمنى في منحنى الشكل النهائي هذا بواسطة برنامج متعدد الدورات كشف أن الخلايا المتراكمة بشكل أساسي في G المرحلة الواحدة بعد تعبير PRB.

في حين أن السكان في مرحلتي s و G اثنين M كانوا مستنفدين نسبيا. بمجرد إتقانها ، يمكن تكييف هذه التقنية لدراسة علامات دورة الخلية الأخرى مثل هيستونات الفوسفوريلات في ميل في الساعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد توزيع دورة الخلية لمجموعة من الخلايا.

لا تنس أن حمض الهيدروكلوريك العادي كاوي وبروبيديوم. اليوديد مادة مسرطنة محتملة. يمكن أن تكون خطرة في.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء استخدام هذه المواد الكيميائية.