Name: Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: تعلم تقنية التلطيخ المناعي السريع لقلوب أجنة أسماك الزرد لتحسين اختراق الأجسام المضادة والحصول على صور عالية الدقة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة البنية الخلوية في أبحاث علم الأحياء التنموي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر Beninio Jomok لمساعدته في تربية الزرد. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL81753.

1. إعداد الشرائح وغرفة ترطيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن جعل غرفة ترطيب من مربع مثل مربع تلميح تفرغ. التفاف كل من الغرفة وتغطية برقائق الألومنيوم لحماية العينات بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل الغرفة ، ووضع كومة من المناشف الورقية الرطبة للحفاظ على الرطوبة داخل الغرفة ، والتي سوف يمنع عينات من القلب التجفيف. تعيين microplate صغيرة على الجزء العلوي من منشفة ورقية كما رف للشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم خطوط أو دوائر إما على سطح شريحة المجهر باستخدام القلم immEdge جعل الآبار للحصول على عينات من القلب مع البعد عن 5x5 ملم. السماح للشرائح الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح في غرفة ترطيب وإضافة جديدة 50ul الفورمالديهايد 4 ٪ في كل بئر. </li></ol> 2. تشريح القلب الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الجنين الأسماك في المياه التي تحتوي على البيض E3 7 tricaine 0.4 ٪ لمدة دقيقة تقريبا حتى 1 الأسماك وقف حركة الجسم ولكن لا يزال القلب الطبيعيالضرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة المجهر مقعرة على مرحلة مجهر تشريح. نقل الأجنة إلى البئر concaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيبة ضوء مجهر تشريح لتكشف بوضوح القلب. اعتمادا على تفضيل شخصي ، قد يكون إما حقل مظلم أو مدينة دبي للإنترنت ، مثل حالة الضوء المستقطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاقن نظيفة الأنسولين مع اثنين من الايثانول 75 ٪ ، ثم الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مجهر تشريح لارتفاع التكبير والتركيز على القلب. الإصلاح جسديا الجنين عن طريق إدخال إبرة في طرف واحد الحدود صفار البيض الجسيدة قريبة من الرأس. ادخال آخر قريب الإبرة إلى منطقة القلب وسحب القلب بسرعة. إذا لم يتم فصلها تماما عن قلب الجنين ، قطع الأنسجة المتبقية المتصلة بين القلب وصفار البيض و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المجهر لخفض التكبير والتركيز على القلب المشتتة. استخدام pipetteman 10μl وتعيينها إلى حجم 1μl. تطبيق غيض من pipetteman لرسم أو لمسقلب العينة ، بحيث ستكون معزولة القلب سواء داخل أو تعلق على سطح الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع غيض ماصة في محلول الفورمالديهايد 4 ٪ على شرائح معدة وتضغط على المكبس ماصة للافراج عن القلب إلى حل. التوتر على سطح الماء يساعد أيضا على إطلاق سراح القلب من ماصة الحافة إلى الحل. وضع أقل من 3 في قلوب كل بئر. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الغرفة ووضعها على شاكر مع حركة هزاز لطيف. الإصلاح العينة القلب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمحو الماء على الجزء الخلفي من الشرائح ووضع الشرائح على مسرح المجهر تشريح لتبادل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع غيض من pipetteman 10μl في منطقة فارغة في كل بئر والحفاظ على تلميح إلى أقصى حد ممكن من عينات القلب. أخذ يحذر لتجنب القلب المترتبة على الحافة ، حيث يمكن أن تتحرك قلوب مع تدفق المياه عندما يوجه الى حل غيض. تغييرتوطين الطرف ، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلص من حل على منديل ورقي وتجنب إنتاج أي فقاعات في الطرف منذ يضيع بسهولة العينة القلب في وجود فقاعات الهواء. يمكن الحفاظ على العينات القلب الجافة جزئيا لفترة قصيرة تساعد على قلوب البقاء تعلق على الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μl PBST لتغطية عينة القلب واحتضان في غرفة ترطيب في حركة بطيئة هزاز لمدة 5 دقائق. تكرار شطف مرة أخرى. بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينات القلب في غرفة ترطيب تصل إلى 1 في الاسبوع 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة العينة القلب مع مصل الأغنام 10 ٪ في PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينة القلب مع الأجسام المضادة الأولية ، مثل تخفيف 1:200 β - catenin الأضداد و1:200 تخفيف mef2 الضد محددة ، في الأغنام 10 ٪ مصل / PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل القلب مع عينة مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينة مع الثانويالأضداد ، مثل تخفيف 1:1000 اليكسا الموسومة الماوس المضادة و / أو الأجسام المضادة المقاومة للأرنب ، في PBST عن 0.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل القلب مع عينات مرات PBST الثلاثة (5 دقائق. لكل منهما) في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBST وإضافة 10 ميكرولتر متوسطة متزايدة لكل بئر. صخرة الغرفة لعدة دقائق حتى يصبح الحل واضحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة معظم المتوسطة التركيب وتغطية جميع الآبار في شريحة واحدة مع ميكروسكوب الغطاء (24x50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة القلب الأسماك باستخدام مجهر زايس Axioplan 2 مجهزة ApoTome (كارل زايس). </li></ol> 5. ممثل النتائج ويظهر مثال الصورة التي تكشف الغشاء ونوى جميع العضلية الزرد في الشكل. 1. واستخدمت والأضداد mef2c β catenin معا لصبغ العينات القلب تشريح الجنين من 52 HPF الزرد. بينما بقع الضد mef2c نوى الخلايا العضلية ، β - cateninالضد يكشف حدود كل خلية 80-10. عن طريق ضبط مرحلة من مراحل المجهر المركب ، يمكن تعديلها صورا لعينات من القلب الى التوجه نفسه ، والتي سوف تسمح للمراقبة انحناء الخارجي والداخلي انحناء في القلب 11. ويمكن بعد ذلك عدد cardiomyocyte مجموع cardiomyocyte حجم الخلية ، ويمكن قياس دائرية. مثال آخر هو مبين الذي يكشف عن بنية sarcomeric من القلب الجنينية في الشكل. 2. أجرينا immunostaining باستخدام F59 ، وهو جسم الميوسين ، في قلب جنينية تشريح. ويمكن للشبكة myofibril في قلب جنينية كشفت بوضوح كامل في أقل التكبير ، بينما يمكن كشف الفرقة المخططة من خيوط سميكة على أعلى التكبير (الشكل رقم 2) 6. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> الشكل 1. Immunostaining من mef2 (الحمراء) ، وβ - catenin (الخضراء) لإظهار النوى وoutlإيناس الخلايا العضلية في البطين الزرد. شريط مقياس = 10μm <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> الشكل 2. Immnostaining من الميوسين لاظهار خيوط سميكة في البطين الزرد إما في التكبير المنخفض (أ) أو تكبير عالية (B). شريط مقياس = 10μm

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
<li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cardiac+development%3A+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li>
<li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart%3A+A+functional+study+of+tnnt2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , (2007).</li>
<li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle%3A+the+regulation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li>
<li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo%22%5BJournal%5D)">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li>
<li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li>
<li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية كلها immunostaining جبل ، لدينا وسيلة لديه المزايا التالية. أولا ، يمكن الفلورسنت أقوى بكثير الإشارات التي تم الحصول عليها باستمرار نظرا لتغلغل المحسنة. في أسلوب جبل immunostaining كله ، وأنسجة الجلد الكثيفة المحيطة القلب إلى خفض كبير في اختراق العديد من الأجسام المضادة ، مما أدى إلى ارتفاع الخلفية في الجسم كله. هذه المشكلة الحادة وخاصة بالنسبة للأجنة مضى عليها أكثر من 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). في المقابل ، فإن قلوب تشريح تتألف فقط من طبقات الخلايا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> tricaine </td><td> البحوث العضوية </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> الفورمالديهايد </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> حقنة الانسولين </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> تريتون - X - 100 </td><td> سيغما </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> مكافحة β - catenin الأضداد </td><td> سيغما </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للMef2c </td><td> سانتا كروز في مجال التكنولوجيا الحيوية </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة α - actinin الأضداد </td><td> سيغما </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للأمثاله </td><td> الخلية إشارات </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> ثر اليكسا 568 عنزة المضادة مفتش الأرنب </<html> TD&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> ثر اليكسا 488 عنزة المضادة الماوس IgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> تصاعد المتوسطة لمضان </td><td> النواقل </td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge القلم </td><td> النواقل </td><td> H - 4000 </td></tr><tr><td> بولي - L - lysin الشرائح المغلفة </td><td> الإلكترون المجهري العلوم </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> مجهر الغطاء الزجاجي </td><td> الصياد </td><td> 12-543 - D </td></tr><tr><td> شرائح المجهر Concaved </td><td> الصياد </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td> ايكا MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> مجمع المجهر </td><td> زايس </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> زايس </td><td></td></tr></tbody></table> PBST : 1 × PBS 0.5 ٪ تريتون 100 - X الأنف والحنجرة &quot;&gt; 25X Tricaine : 400 ملغ Tricaine 97.9 مل DDH 2 O 2.1 مل (1M تريس pH9) ضبط درجة الحموضة إلى 7.0

immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

الزرد الجنين تصبح شعبية في الفقاريات نموذج الجسم الحي لدراسة التنمية القلب وأمراض القلب البشري بسبب علم الأجنة وعلم الوراثة لها فائدة 1،2. حوالي 100-200 الأجنة متوفرة في كل أسبوع من زوج واحد من السمك الكبار. الأجنة الشفافة التي وضع الرحم السابقين يجعلها مثالية لتقييم عيوب القلب 3. ويمكن التلاعب بها على التعبير عن أي الجينات عبر تقنية الحمض النووي الريبي morpholino أو الحقن 4. علاوة على ذلك ، لقد ولدت قدما شاشات الوراثية بالفعل قائمة من المسوخ التي تؤثر على وجهات نظر مختلفة لتخلق القلب 5. جبل immunostaining كله هو أسلوب هام في هذا النموذج الحيواني للكشف عن نمط التعبير عن هذا البروتين إلى الأنسجة المستهدفة خاصة 6. ومع ذلك ، فقد كانت الصور ذات الدقة العالية التي يمكن أن تكشف عن الهياكل الخلوية أو التحت خلوية الصعبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى locat البدنيةايون القلب وتغلغل الفقيرة من الأجسام المضادة. هنا ، نقدم طريقة لمعالجة هذه الاختناقات التي تشريح قلبية للمرة الأولى وإجراء عملية التلوين ثم على سطح شريحة المجهر. لمنع فقدان العينات الصغيرة والقلب لتسهيل التعامل مع حل ، ونحن يقتصر عينات القلب ضمن دائرة على سطح المجهر الشرائح التي رسمها قلم immEdge. بعد التلوين ، ويمكن للاشارات مباشرة عن طريق الملاحظة مضان المجهر المركب. لدينا وسيلة جديدة تحسن كبير في اختراق للأضداد ، لأن القلب من الأسماك الجنينية يتكون فقط من طبقات الخلايا قليلة. ويمكن الحصول على صور ذات جودة عالية من قلوب سليمة ضمن الموكب الكثير من الوقت لخفض الأجنة الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين يوم 2 إلى 6 أيام. يمكن أن يكون لدينا وسيلة لتمديد يحتمل صمة تشريح الأجهزة الأخرى سواء من الزرد أو الحيوانات الصغيرة الأخرى.

وصفت وسيلة سريعة لإجراء immunostaining القلب الجنينية الزرد. بالمقارنة مع نهج جبل immunostaining كله ، هذا الأسلوب يزيد بشكل كبير من انتشار الأجسام المضادة ، والذي يسمح بالحصول على صور عالية الدقة التي تكشف عن الهياكل الخلوية / التحت خلوية في القلب في غضون فترة زمنية أقل بكثير التجهيز.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

أصبح جنين سمكة الزيبرا نموذجاً شائعاً للفقاريات في الجسم الحي لدراسة التطور القلبي وأمراض القلب البشرية نظراً لميزاته الجنينية...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء الصبغ المناعي على قلوب أجنة سمك الزيبرا المشرحة للكشف عن التراكيب الخلوية أو دون الخلوية بدقة عالية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير الشرائح في غرفة ترطيب لعملية الصبغ المناعي، ثم يلي ذلك تشريح القلب من جنين سمك الزيبرا المخدر، ومن ثم إجراء الصبغ المناعي على قلب الجنين باستخدام جسم مضاد محدد.بعد ذلك، يتم توثيق صور قلوب الأسماك باستخدام مجهر مجهز بـ aome. وأخيرًا، يتم الكشف عن التراكيب الخلوية أو دون الخلوية في قلب جنين سمكة الزيبرا باستخدام مجهر الفلورة المناعية نظرًا لزيادة القدرة على النفاذ بشكل كبير. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التلوين المناعي للتثبيت الكامل، في القدرة على الحصول على صور عالية الجودة لقلب سمكة الزيبرا القياسي. ولتحضير غرفة مرطبة وحماية العينات من الضوء، استخدم رقائق الألومنيوم لتغليف الغرفة وغطاء صندوق رؤوس الماصات الفارغ.امنع جفاف العينات عن طريق وضع مجموعة من المناشف الورقية المبللة في قاع الغرفة، ثم ضع صفيحة ميكروية صغيرة فوق المناشف الورقية لتكون بمثابة حامل للشرائح. وباستخدام قلم رسم الصور لعمل الآبار، ارسم إما دوائر أو خطوطاً بأبعاد تبلغ حوالي خمسة في خمسة مليمترات على سطح شريحة مجهرية. اترك الشرائح لتجف.ضع الشرائح في غرفة الترطيب وأضف 50 µL من الفورمالدهيد إلى كل بئر. لتشريح قلب الجنين، قم بتخدير جنين السمكة في مياه بيض E3 تحتوي على 0.4% trica حتى يتوقف جنين السمكة عن جميع حركات الجسم، مع استمرار نبضات القلب الطبيعية. يستغرق ذلك حوالي دقيقة واحدة.انقل الأجنة إلى شريحة مقعرة. ضع شريحة المجهر المقعرة على منصة مجهر التشريح باستخدام إما المجال المظلم أو تباين التداخل التفاضلي (DIC) مثل الضوء المستقطب. اضبط إضاءة المجهر لإظهار القلب بوضوح.بعد ذلك، قم بتنظيف حقنتين من حقن الإنسولين باستخدام ethanol بتركيز 75%. ثم جففهما، وزد تكبير المجهر للتركيز على القلب. بعد ذلك، قم بتثبيت الجنين ميكانيكياً عن طريق إدخال طرف إبرة واحدة في المح، بحيث تكون حدود العث قريبة من الرأس.ثم أدخل إبرة أخرى بالقرب من منطقة القلب، واسحب القلب بسرعة. إذا لم يكن القلب منفصلاً تماماً عن الجنين، فاقطع الأنسجة المتصلة المتبقية بين القلب والمح. ركز على القلب باستخدام قوة تكبير منخفضة.باستخدام ماصة سعة 10 µL مضبوطة على حجم 1 µL، ضع طرف الماصة لسحب عينة القلب أو لمسها، بحيث يصبح القلب المعزول إما بداخل طرف الماصة أو ملتصقاً بسطحه. اغمس طرف الماصة في محلول الفورمالدهيد الموجود على الشرائح المُعدة، ثم اضغط على مكبس الماصة لتحرير القلب في المحلول.بعد وضع القلوب في الفورمالدهيد على شرائح التجويد، أغلق الحجرة وضعها على هزاز مع الرج اللطيف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم امسح الماء الموجود على ظهر الشرائح وضعها على منصة مجهر التشريح لتبديل المحلول المنظم. استخدم ماصة سعة 10 µL لسحب الفورمالدهيد بعناية من الشريحة مع ترك القلوب دون تحريك. أضف 50 µL من PBST لتغطية عينات القلب وحضنها في الحجرة المرطبة لمدة خمس دقائق.اشطف القلوب مرة ثانية في PBST. بعد ذلك، قم بحجب عينة القلب باستخدام مصل أغنام بتركيز 10% في PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتحضين عينات القلب مع أجسام مضادة أولية متخصصة لـ beta catenin و F two بتخفيف من 1 إلى 200 في PBST يحتوي على مصل أغنام بتركيز 10% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.اغسل عينات القلب باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحضين العينات مع تخفيف بنسبة 1 إلى 1000 من Alexa tag، والأجسام المضادة الثانوية المضادة للفئران (anti muse) و/أو المضادة للأرانب (anti rabbit) في PBST لمدة 30 دقيقة. اغسل العينات مرة أخرى ثلاث مرات باستخدام PBST لتصوير العينات.أزل محلول PBST وأضف واحد ميكرولتر 1 µL من وسط التثبيت إلى كل منها. قم بهز الحجرة جيداً لعدة دقائق حتى يصبح المحلول صافياً. قم بتصوير قلب السمكة باستخدام مجهر Zeiss Axio Plan 2 المجهز بـ aome. في هذه الصورة، تم تحديد النوى وأغشية الخلايا لعضلة القلب في أسماك الزبرا من جنين سمكة زبرا بعد 52 ساعة من الإخصاب باستخدام أجسام مضادة ضد MEF2C و betaine على التوالي.من خلال ضبط منصة المجهر المركب، يمكن ضبط صور عينات القلب لتكون في نفس الاتجاه، مما يسمح بملاحظة الانحناء الخارجي والانحناء الداخلي للقلب. ويمكن بعد ذلك قياس العدد الإجمالي للخلايا العضلية القلبية وحجم الخلية العضلية القلبية والاستدارة. يظهر هنا التركيب الساركوميري لقلب جنيني مشرح باستخدام الجسم المضاد للميوسين F 59. وتظهر شبكة الخيوط العضلية في بطين قلب جنيني كامل بوضوح عند التكبير المنخفض، بينما يظهر النطاق المخطط للخيوط السميكة عند التكبير العالي.بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء الصبغ المناعي لقلب سمكة الزيبرا (zebrafish) المفصص، وبشكل خاص، كيفية تشريح القلب من سمكة الزيبرا، وكيفية التعامل مع القلب أثناء عملية الصبغ المناعي.

immunostaining-of-dissected-zebrafish-embryonic-heart

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ووصف واضح وطريقة موحدة للتشريح والعزلة من القلب الزرد في مراحل تنموية متعددة. وتناقش أيضا الشرح وتقدير التقنيات.

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

الزرد يمثل نموذجا قيما لدراسة آليات تجديد القلب في الفقاريات. هنا، نقدم بروتوكول للتحريض من احتشاء القلب في الزرد الكبار باستخدام cryoinjury. هذا الأسلوب يؤدي إلى موت الخلايا هائل في غضون 20٪ من جدار البطين، مماثلة لتلك التي لوحظت في عوائق الثدييات.

الاستقراء من احتشاء عضلة القلب في الزرد الكبار باستخدام Cryoinjury

يصف هذا الفيديو تقنية عزل القلب عن سمكة الزرد في مراحل نمو متعددة لدراسة نمو القلب والنضج والشيخوخة.

تشريح القلب: طريقة لمراقبة تطور قلب الزرد

لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

يتوسع استخدام أسماك الزرد لأبحاث القلب والأوعية الدموية نحو البحث عن قلوب البالغين. بالنسبة لهذه التطبيقات ، يعد العزل السريع والبسيط لأنسجة القلب أمرا أساسيا لتجنب تغييرات ما بعد الوفاة والحصول على عدد كاف من العينات. هنا ، نصف طريقة سريعة وقابلة للتكرار لتشريح قلوب أسماك الزرد البالغة.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

تستفيد الطفرات التي تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية من التحقيق في الجسم الحي لبنية القلب أثناء التطور ، لكن الدراسات الهيكلية عالية الدقة في القلب الجنيني للفأر تمثل تحديا تقنيا. نقدم هنا طريقة قوية للتألق المناعي وتحليل الصور لتقييم الهياكل الخاصة بخلايا عضلة القلب في قلب الفأر النامي.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

ويبين هذا البروتوكول الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على التبريد من أجنة سمك الحمار الوحشي في المرحلة المبكرة مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة للتوطين المشترك في مجموعات خلايا محددة.

الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على أجنة حمار وحشي مقطعة بالتبريد

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

يستخدم هذا البروتوكول فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM2.5في القلوب التشريحية لأجنة حمار وحشي.

باستخدام Immunofluorescence للكشف عن PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلوب الأجنة حمار وحشي

نحن نصف الأدوات المحسنة لدراسة قلب حمار وحشي في الجسم الحي مع المجهر مضان ورقة الضوء. على وجه التحديد، نقترح خطوط القلب المعدلة وراثيا مشرق وتقديم تقنيات جديدة لطيف تضمين وشل الحركة التي تجنب عيوب النمو والقلب. كما يتم توفير خط أنابيب محتمل للحصول على البيانات وتحليلها يتكيف مع تصوير القلب.

المجهر ورقة خفيفة من ديناميات القلب السريع في أجنة حمار وحشي

تؤسس هذه الدراسة طريقة تصوير حساسة تعتمد على التألق المناعي لقياس مثيلة الحمض النووي العالمية في قلوب جنينة سمكة الزرد الفردية. يتغلب هذا النهج على تحدي محدودية مادة الأنسجة ويتجاوز الحاجة إلى تحويل البيسلفيت.

الكشف عن مثيلة الحمض النووي العالمية في قلوب يرقات سمك الزبرا

تعلم تقنية التلطيخ المناعي السريع لقلوب أجنة أسماك الزرد لتحسين اختراق الأجسام المضادة والحصول على صور عالية الدقة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة البنية الخلوية في أبحاث علم الأحياء التنموي.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

استكشف المزيد من الفيديوهات