العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

تستخدم هذه التجربة تقنيات فيزيائية حيوية لتقييم قدرة التشابك للبوليمر الواقي واللطيف في الطماطم، ولمراقبة الإزالة الانتقائية للشمع فوق والداخل الكيوتيكولي من كيوتيكل الثمار. ويتم عزل الكيوتيكل من الثمرة الكاملة عن طريق المعالجة الإنزيمية لقشور الطماطم وجدران الخلايا الملتصقة بها. وفي خطوة ثانية، يُستخدم الاستخلاص لإزالة الشمع من كيوتيكل الثمرة بشكل شامل من أجل الحصول على التوصيف الجزيئي للكوتين من الكوتين المعزول.

يتم تحليل البوليستر الحيوي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي في الحالة الصلبة. ويكشف التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي في الحالة الصلبة أن هناك اختلافات في النسب النسبية للمجموعات الألوفاتية المؤكسجة القادرة على التشابك في الكيوتين المستخلص من أديم ثمار الطماطم من النوع البري والنوع المعدل وراثياً. وبدلاً من ذلك، يتم طلاء الثمرة بأكملها وتقشيرها باستخدام الصمغ العربي لإزالة شمع الأديم الخارجي، ثم تُغمس في الكلوروفورم لإزالة الشمع الموجود داخل الأديم من أديم الثمرة.

بعد ذلك، يتم فحص طبقات الكيوتيكل التي أزيل جزء من شمعها، والتي عُزلت باستخدام نفس المعالجة الإنزيمية المستخدمة لقشور الطماطم، وذلك باستخدام الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (solid state NMR) ومجهر القوة الذرية (atomic force microscopy). وفي النهاية، يتضح الإزالة المتسلسلة للشمع فوق الكيوتيكل والشمع داخل الكيوتيكل من خلال ملاحظة تلاشي تدريجي لقمة الشمع في أطياف NMR والتغيرات في ملف تعريف سطح كيوتيكل الثمرة التي لوحظت عبر تصوير AFM المتزامن. تُحمى الأعضاء فوق الأرضية للنباتات بواسطة تجمع شمعي من البوليستر الحيوي يسمى الكيوتيكل. وسنعرض بروتوكولات لتقييم الإزالة الانتقائية للشمع الداخلي والخارجي من كيوتيكل ثمار الطماطم باستخدام الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة ومجهر القوة الذرية.

يمكن استخدام هذه الطرق أيضاً لتقييم قدرة التشابك في المواد الجلدية المهندسة. سيقوم بتوضيح الإجراءات ثلاثة من أعضاء مجموعة ستارك، وهم الدكتورة Ishish Chatterjee، والمرشحة لنيل درجة الدكتوراه Shantani Sarkar، والطالبة السابقة في المرحلة الثانوية Julia Tik. كما تشارك في التوضيح الدكتورة Olivia Nisau، وهي زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبر زميلنا في الهندسة الكيميائية، الدكتور Alexander S. لبدء العزل الإنزيمي لقشرة الطماطم، ضع ثلاث ثمرات تجارية أو مزروعة في وعاء، وقم بتقشير الجلد في أقسام كبيرة وتخلص من نسيج الغلاف الثمري الداخلي.

بعد ذلك، تُغسل قشور الطماطم بالماء منزوع الأيونات وتُحفظ تحت الماء في بيكر، مع غمر قشور الطماطم المقشرة تماماً في خليط إنزيمي مُحضّر كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تُحضن العينات عند درجة حرارة 31 درجة Celsius لمدة 24 ساعة مع الرج المستمر. تُجمع قشور الطماطم باستخدام قمع بيور أو مصفاة مطبخ، ثم تُغسل بالماء منزوع الأيونات.

بعد وضع القشور في فرن تفريغ عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، يمكن تخزين القشور المجففة في زجاجة محكمة الإغلاق ومصنفة. بالنسبة لإجراءات إزالة الشمع اللاحقة، املأ أنبوباً زجاجياً مركزياً أو أنبوباً قابلاً للتخلص منه حتى المنتصف تقريباً بعينة كيوتيكل الطماطم، واستخدم الملاقط لوضعها بعناية عند قاعدة عمود الاستخلاص الذي سيتم استخدامه في استخلاص SOLI. استمر في تجهيز جهاز SOLI باستخدام مذيب الميثانول كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

راقب العملية لمدة ساعة، مع ضبط جهد الفاريأك (variac) بحيث يجمع الخزان حوالي قطرة واحدة في الثانية ويحدث السحب داخل الجوارب التي تكسو الجهاز. عندما يمتلئ الكيم (thimble)، وذلك بعد عملية استخلاص استمرت 12 ساعة، اترك الجهاز ليبرد، ثم اخفض غطاء التسخين وانزع المستخلص والخزان كوحدة واحدة للتخلص من المذيب بعد الاستخلاص. أَمِل العمود للسماح بسحب السائل إلى القارورة الموجودة بالأسفل.

استخدم ملقطاً لرفع الكوب المسامي إلى مستوى أسفل عنق عمود الاستخلاص مباشرة. قم بتصريف المذيب الزائد منه، ثم ضع الكوب المسامي على سطح نظيف. افصل القارورة واسكب النفايات في وعاء مخصص للمذيبات وموضع عليه ملصق تعريفي.

كرر إجراء الاستخلاص باستخدام مذيبات متتالية تتناقص قطبيتها تدريجياً، مثل الكلوروفورم والتكسان لمدة 12 ساعة لكل منهما. وبمجرد جفاف عينة بشرة الطماطم، قم بقياس الكتلة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة داخل وعاء ذي غطاء لولبي محكم الإغلاق باستخدام البارافيلم. ولتحضير العينة لتحليل NMR، ضع من أربعة إلى ستة مليغرامات من بشرة الطماطم المزالة الشمع بالكامل والمسمى كوتين في دوار زركونيا fast MAS بقطر 1.6 مليمتر باستخدام أداة التعبئة الموردة من الشركة المصنعة.

بعد تركيب الغطاء العلوي، قم بطلاء نصف الغطاء باستخدام قلم تحديد حبري أسود للسماح بقياس معدل الدوران. يُعد الإعداد الأولي لتجربة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (solid state NMR) عملية متطلبة تقنياً ويتم إنجازها تحت إشراف موظفين ذوي خبرة. ابدأ بضبط تجانس المجال المغناطيسي وتحسين المعلمات التجريبية باستخدام مركب نموذجي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، ثم أدخل الدوار المجهز والمعبأ في المسبار، وبعد ذلك ضع المسبار داخل المغناطيس.

قم بزيادة سرعة الدوران تدريجياً حتى 10 kilohertz للتحقق من تعبئة العينة بشكل جيد وقدرة الدوار على الدوران باستقرار مع تباين يقل عن 20 hertz. قم بضبط مكثفات الضبط والمطابقة للمسبار بشكل تكراري لتحقيق أدنى انعكاس للقدرة عند ترددي الرنين المغناطيسي النووي (NMR) للبروتون والكربون 13. اضبط درجة حرارة التجربة على 25 °C.

ابدأ تجربة CPMA المجهزة مسبقاً والتي تتوافق مع حالة مطابقة البروتون والكربون وفق طريقة Hartman Han التي تم تحديدها عند تردد دوران 10 kilohertz. بعد الحصول على 4,096 transient، قم بمعالجة الطيف باستخدام توسيع خطي أسي يتراوح بين 50 إلى 100 hertz، ثم أجْرِ تحويلاً فورياً (Fourier transform) لإنشاء طيف NMR يوضح شدة الإشارة مقابل الحجب الكيميائي مقاساً بأجزاء في المليون. قم بمرجعة الإزاحات الكيميائية للكربون 13 كما هو موضح في النص.

ارفع تردد دوران الدوار إلى 15 kilohertz وكرر قياس C-P-M-A-S المقابل لشرط مطابقة Hartman Han الذي تم تحديده عند تحليل الإزاحة الكيميائية لتردد دوران السلم الخاص بـ C-P-M-A-S carbon. 13 NMR Spectra، حيث حددت المجموعات الوظيفية الرئيسية الموجودة في جلد الطماطم الشمعي المنزوع الشمع تمامًا بـ DW، والـ PHAs طويلة السلسلة، والـ PHAs المؤكسجة، والمركبات متعددة الروابط والعطريات وعوائد الكربون. تلعب الـ almo المؤكسجة دورًا حاسمًا في إنشاء روابط تساهمية بين الوحدات المونومرية للبوليمر الحيوي كيوتين، مما يشكل البنية الجزيئية لمصفوفة الكيوتين.

تشير الاختلافات في مساحات القمم النسبية الملاحظة في المنطقة الطيفية بين 45 و 100 parts per million إلى أن الكيوتين الطافر يحتوي على نسبة كبيرة نسبيًا من مجموعات CHO البنائية المكونة للروابط التشابكية مقارنة بالنوع البري. لبدء العزل الانتقائي للشمع فوق الكيوتيكولي والشمع داخل الكيوتيكولي.

اغسل دفعة ثانية من حبات الطماطم الكاملة بالماء المقطر. جففها باستخدام مناشف ورقية ومناديل Kim wipes، ثم ضعها بحيث يكون الساق متجهاً للأسفل على قطعة من ورق الألمنيوم. ادهن حبات الطماطم الكاملة من الأعلى إلى الأسفل بمحلول مائي من الصمغ العربي بتركيز 120%.

اترك الصمغ العربي ليجف على قشرة الفاكهة لمدة ساعة واحدة، مما يترك غشاءً رقيقاً. قم بإزالة هذا الغشاء باستخدام الملاقط، مع تجنب ثقب قشرة الطماطم. وتؤدي المعالجة الإضافية للغشاء كما هو موضح في النص إلى الحصول على شمع الطبقة الخارجية من البشرة.

ستبقى ثمار الطماطم سليمة من الناحية الفيزيائية. قم بغمسها في الكلوروفورم لمدة دقيقتين. وفي درجة حرارة الغرفة، يمكن جمع الشمع الموجود داخل البشرة بعد تبخير المذيب، ثم قم بتقشير ثمار الطماطم ومعالجتها إنزيميًا باستخدام السليولاز والبكتينات ومحلول منظم من خلات الصوديوم لإزالة السليلوز والبكتين على التوالي.

يمكن بعد ذلك إجراء استخلاص باستخدام السالي كما تم وصفه سابقاً لإزالة الشمع من الطماطم بشكل شامل. يمكن تكرار تجارب C-P-M-A-S باستخدام عينات من كيوتيكل ثمار طبيعية وأخرى تمت إزالة الشمع منها جزئياً كما هو موضح في النص. تُعد عملية إعداد مجهر القوة الذرية عملية معقدة، ويفضل إجراؤها تحت الإشراف الأولي من قبل طاقم فني ذو خبرة. يبدأ استخدام مجهر القوة الذرية بتشغيل مجهر المسبار الماسح، المختصر بـ SPM، والتأكد من ضبط مفتاح تبديل وضع المجهر على وضع مجهر القوة الذرية التماسي.

بعد ذلك، ارفع رأس مجهر SPM يدوياً عن طريق تدوير المقبضين الأماميين القابلين للتعديل. قم بفصل حامل طرف a FM من رأس SPM عن طريق تدوير برغي التثبيت الموجود في الجزء الخلفي من الرأس. استخدم ملقطاً لإزالة عارضة a FM الموجودة من حاملها.

بعد ذلك، أمسك بعناية برافعة جديدة ذات طرف من نتريد السيليكون من عبوتها وقم بتركيبها مكان الرافعة القديمة. استخدم مجهراً ضوئياً للتحقق من أن رافعة FM التي تم تركيبها حديثاً ليست مكسورة. قم بتثبيت عينة كيوتيكل الطماطم على قرص العينة باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه.

استخدم مجهراً ضوئياً للتأكد من أن عينة البشرة تظل مسطحة وملساء. بعد وضع العينة على القرص، ضع عينة بشرة الطماطم المثبتة على القرص فوق المنطقة المغناطيسية في الجزء العلوي من ماسح SPM. عن طريق تدوير المقابض، اضبط المسمارين اليدويين الأماميين للماسح على ارتفاع كافٍ لتجنب كسر طرف AFM.

عند وضع حامل السن في رأس مجهر المسح المسباري (SPM)، اضبط برغي الخلف الآلي ليكون في نفس مستوى البرغيين الأماميين تقريبًا. أعد إدخال حامل السن في رأس مجهر SPM وثبته عن طريق إحكام ربط برغي التثبيت الخلفي للرأس. بعد تشغيل الليزر، قم بمحاذاة بقعة الليزر على عارضة FM باستخدام مقابض ضبط الليزر المركزية واليمنى الموجودة في أعلى الرأس.

راقب شعاع الليزر المنعكس على قطعة من الورق لتحديد موضع بقعة الليزر بدقة عند طرف عارضة FM. اضبط موضع بقعة الليزر لتحقيق أقصى قيمة لإشارة المجموع. قم بتنظيم موضع بقعة الليزر المنعكسة على الكاشف الضوئي عن طريق ضبط موضع المرآة المتحركة أفقيًا وعموديًا لضمان استقبال الضوء الساقط بشكل متساوٍ بواسطة الأرباع الأربعة.

يخفض الكاشف طرف الـ FM عن طريق سحب البراغي الأمامية التي يتحكم بها المستخدم والبرغي الخلفي الآلي لماسح الـ SPM. يتم مراقبة اقتراب طرف الـ FM من سطح العينة بصرياً باستخدام مجهر مقلوب. تأكد من أن البراغي الثلاثة جميعها على نفس المستوى.

لتجنب ظهور الشوائب الناتجة عن تصوير عينة مائلة، قم بتقريب الرأس نحو العينة ولكن ليس لدرجة تلامس سطح العينة أو اختراقه. سينعكس ضوء الليزر عن عارضة A FM ليرتد من مرآة متحركة إلى كاشف حساس للضوء لنمط التلامس a FM باستخدام مسبار a FM من نتريد السيليكون. اضبط جهد إشارة المخرج على -2 volts لنقطة ضبط صفر فولت، واضبط الإشارة التفاضلية على 0 volts من خلال تعديل وضعية المرآة.

باستخدام برنامج nano scope، انقر فوق أيقونة المجهر وحدد الملف الشخصي المناسب. وباستخدام لوحة إعدادات التحكم في المسح، اضبط معدل المسح وحجم المسح.

اسمح لطرف مجهر القوة الذرية (AFM) بالاتصال بسطح العينة من خلال النقر على أيقونة "engage tip". سيقوم البرنامج الآن بخفض الطرف حتى يتصل بسطح العينة عن طريق التحكم في المسمار الخلفي الآلي لقاعدة مجهر المسح المسباري (SPM). ستيدأ عملية المسح تلقائياً بمجرد اتصال الطرف بنجاح.

راقب عملية المسح باستخدام وضعي الصور والمجهر (scope) في البرنامج، وقم بتعديل المعلمات بشكل تكراري لتحقيق أعلى دقة للصور كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. على سبيل المثال، ابدأ المسح بقيمة مقياس بيانات كبيرة للمحور Z، ثم قم بتقليل قيمة مقياس بيانات Z بعناية للحصول على أفضل تباين لسمات السطح في الصورة.

التقط الصورة لحفظ ملف البيانات. قم بمعالجة البيانات باستخدام وظائف التسطيح (flattening functions) لإزالة عيوب الصورة الناتجة عن انزياح الماسح الضوئي الرأسي وتقوس الصور والإزاحة الرأسية بين خطوط المسح. وأخيراً، احسب متوسط الخشونة الكربونية.

أظهرت أطياف 13 C-P-M-A-S-N-M-R تناقصاً تدريجياً في ذروة الشمع عند 31 parts per million، مما يشير إلى الإزالة المتسلسلة للشمع فوق والداخل القشري من مركب القشيرة والشمع مع الحفاظ على البنية الكيميائية الأساسية لمتوازي البوليمر الحيوي كيوتين. وكشف تحليل صور FM عن وجود عدم انتظام في السطح نتيجة للاستخلاص التدريجي للشمع فوق القشري والشمع داخل القشري من قشيرة الثمرة، مما يدل على حدوث تغيرات في تنظيم التجمع القشري. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراء الإزالة المتسلسلة للشمع فوق والداخل القشري من قشيرات ثمار الطماطم في غضون ساعتين.

عند إجراء استخلاص بالمذيبات من أجل الإزالة الشاملة لطبقات كيوتيكل الثمار، من المهم استخدام مجموعة من المذيبات ذات قطبية متفاوتة بعد استخدام عقدة التلامس. يوضح البروتوكول الخاص بـ FM هنا ذلك. ويمكن استخدام تجارب FM إضافية لقياس مرونة سطح الكيوتيكل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل المكونات بشكل منهجي من مركب الكيوتين والشمع (cutin WAX composite)، وإجراء التوصيف الجزيئي والفحص السريع لسطح مواد البشرة باستخدام الرنين المغناطيسي النووي في الحالة الصلبة (solid state NMR) ومجهر القوة الذرية (AFM) على التوالي. تتيح التقنيات الموضحة في هذا الفيديو للباحثين في بيولوجيا النبات تحديد التركيب الجزيئي والبنية فوق الجزيئية للأنسجة النباتية الطبيعية والمعدلة هندسياً.