والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين

الهدف من هذا الإجراء هو وصف نظام تجريبي لدراسة التحويل الميكانيكي في خلايا الرئة الجنينية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء أطباق الزرع ببروتينات المصفوفة خارج الخلوية. بعد ذلك، يتم عزل الخلايا الظهارية من النوع الثاني في رئة الفأر الجنينية، يلي ذلك عزل الخلايا الليفية من الفأر الجنيني.

تصف الخطوة النهائية نظاماً مخبرياً (in vitro) لتوفير تحفيز ميكانيكي لخلايا الرئة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر زيادة في تمايز خلايا النوع الثاني من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، وبصمة ويسترن (western blot)، وصور الكيمياء المناعية الفلورية. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التحويل الميكانيكي، مثل تطور الرئة الجنينية وإصابات الرئة.

سيقوم جوليان غو، وهو فني من مختبري، بشرح الإجراء. بينما نعمل داخل غطاء التدفق الصفائحي تحت ظروف معقمة، يتم تحضير 120 ميكروجرام من اللامينين باستخدام 12 ملليلتر من 1XPBS المعقم والبارد لكل لوحة. يمكن استخدام بروتينات مصفوفة خارج خلية أخرى للطلاء. يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب للحصول على التفاصيل، ثم خذ لوحة BioFlex غير معالجة وأضف ملليلترين من محلول اللامينين إلى كل بئر للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكروجرام لكل سنتيمتر مربع.

تأكد من تغطية الآبار بالكامل بالمحلول. غطِّ الطبق تماماً بغلاف بلاستيكي وضعه على سطح مستوٍ في بيئة درجة حرارتها 4 °C طوال الليل للسماح للمادة الرقائقية بالامتصاص في قاع الآبار. يمكن تخزين الأطباق المطلية تحت هذه الظروف لمدة أسبوع على الأقل مع الاحتفاظ بوظيفة ECM جيدة في اليوم التالي.

تحت ظروف معقمة، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1xPBS. ثم أضف مليلتر واحد من 1% BSA في 1xPBS إلى كل بئر. قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لسد مواقع الارتباط غير النوعية على الأغشية.

بعد ذلك، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام XPBS. ولإزالة البروتينات غير الممتصة، أضف 1 mL من DMEM إلى كل بئر من آبار الطبق. ثم احفظ الطبق عند درجة حرارة 37 °C حتى يتم عزل الخلايا الظهارية من النوع الثاني لرئة القوارض الجنينية وتصبح جاهزة للزراعة.

في اليوم السابق لبدء إجراء عزل الخلايا، قم بتجميع أكواب الغربلة المزودة بشبكات نايلون بمسام 130 و 15 ميكرون وعقمها باستخدام جهاز التعقيم (autoclave). قم أيضاً بتعقيم نفس العدد من القوارير الزجاجية سعة 150 ملليلتر في يوم الزرع. احصل على الرئات الجنينية من فأرة حامل في اليوم 17 إلى 19 من الحمل (E 17 to 19).

انقل النسيج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter يحتوي على وسط DMEA وضعه على الثلج. قم بتحضير محلول هضم (digestion buffer) طازج في أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter وفقاً للوصفة المذكورة في البروتوكول المكتوب. وأثناء العمل داخل غطاء تدفق صفائحي (laminar flow hood)، قم بتعقيمه عن طريق الترشيح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.2 micron.

تعد 10 milliliters من هذا المحلول المنظم كافية لأنسجة الرئة المستخرجة من 20 fetus فأر تقريبًا. ضع الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على محلول الهضم في حمام مائي عند 37 °C. أخرج العينة من الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على أنسجة الرئة الجنينية وانقل الأنسجة إلى طبق Petri معقم باستخدام مقصات معقمة أو شفرة حلاقة، ثم قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع يقل حجمها عن 1 millimeter.

ثم انقل النسيج إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على محلول الهضم المسخن مسبقاً. بعد ذلك، ساعد عملية هضم النسيج ميكانيكياً عن طريق سحب ودفع معلق خلايا الرئة الجنينية باستخدام الماصات مائة مرة لكل منها، مع استخدام ماصات ذات فتحات متناقصة الحجم. بعد اكتمال عملية الهضم، قم بطرد متجانس العينة مركزياً عند 1,300 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط، ثم أعد تعليق الراسب الذي يحتوي على الخلايا في 15 milliliters من DMEM مضافاً إليه 20%FBS. بعد ذلك، أحضر أكواب الغربلة ذات المشابك النايلونية بفتحات 130 و15 micron وضعها فوق كؤوس معقمة سعة 150 milliliter. قم بنقل متجانس الخلايا باستخدام الماصة فوق المشبك ذو الـ 100 micron.

اجمع الراشح وانقله باستخدام الماصة إلى شبكة بمسام حجمها 30 micron. اغسل الشبكة ذات المسام 30 micron عدة مرات باستخدام وسط DMEM طازج مضاف إليه 10%FBS. تتكتل معظم الخلايا من النوع الثاني ولا تمر عبر الشبكة.

تعمل عمليات الغسيل هذه على إزالة الخلايا غير الظهارية التي قد تكون ملتصقة بالتكتلات. ضع الرشاحة الناتجة عن الشبكة ذات الـ 30 micron في كوب مصفاة الشبكة ذات الـ 15 micron. ثم كرر عملية الغسيل عدة مرات كما سبق.

تهدف هذه الخطوة إلى استخلاص خلايا النوع الثاني التي قد تكون قد نفذت عبر شبكة 30 ميكرون. اجمع الخلايا غير المفلترة المتكتلة من شبكتي 30 و15 ميكرون لإجراء المزيد من إثراء خلايا النوع الثاني. احتفظ بالراشح من شبكة 15 ميكرون في حال الرغبة في استزراع الخلايا الليفية لرئة القوارض الجنينية.

وإلا، تخلص من هذه الرشاحة. علاوة على ذلك، قم بتنقية مجموعة الخلايا الظهارية من النوع الثاني عن طريق إضافة الوسط وتربيخ الخلايا غير المفلترة من أكواب الشبكة ذات حجم 30 و15 ميكرون في دورق زراعة أنسجة بمساحة 75 سنتيمتر مربع لمدة 30 دقيقة؛ بعد هذه الفترة من التربيخ، قم بطرد مركزي للسائل الطافي كما سبق، ثم افصل الخلايا وأعد تعليق الراسب في 2 مل من وسط DMEM الخالي من المصل المجهز للجنين. انقل باستخدام الماصة 1 مل من معلق الخلايا إلى كل بئر من ألواح BioFlex ذات الستة آبار والمطلية باللامينين؛ في هذه المرحلة، تظهر الخلايا على شكل تكتلات عند فحصها تحت المجهر. قم بتربيخ اللوح في حاضنة زراعة أنسجة مضبوطة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. يعتبر التربيخ لمدة 24 ساعة هو الأمثل، بينما يتطلب الأمر فترة تربيخ لا تقل عن 6 ساعات.

قبل البدء في تجارب الإجهاد الميكانيكي، خذ الراشح من مصفاة الـ 15 micron وانقله إلى دورق زراعة أنسجة بحجم 75 square centimeter عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا الليفية بالالتصاق، ثم اشفط وتخلص من السائل. بعد ذلك، استبدل الحجم الموجود في الدورق بوسط DMEM خالي من المصل وحضنه طوال الليل. وفي اليوم التالي، احصد الخلايا باستخدام 0.25% trypsin في 0.4 millimolar EDTA وازرعها في أطباق BioFlex مغلفة بالـ fibronectin، ثم حضنها في حضانة زراعة أنسجة مضبوطة عند 37 degrees Celsius و 5% carbon dioxide، ويفضل أن يكون ذلك لمدة 24 ساعة قبل البدء في تجارب الإجهاد الميكانيكي.

يلزم تحضين الخلايا لمدة ست ساعات على الأقل إذا كانت التجارب تتطلب عدداً محدداً من الخلايا. يتم الحفاظ على خلايا النوع الثاني في دوارق DMEM خالية من المصل بمساحة 75 سنتيمتراً مربعاً بعد العزل، وفي اليوم التالي يتم تريپسنة الخلايا وعدّها ثم استزراعها. ويجب ألا تتجاوز الطبقة الأحادية نسبة 80% من التلاقي قبل البدء في التجارب. وفي يوم تجربة التحفيز الميكانيكي، يتم استبدال وسط استزراع الخلايا بـ 2 ملليلتر من وسط DMEM الطازج الخالي من المصل لكل بئر، ثم يتم تركيب الطبق في وحدة إجهاد flex cell FX 5,000.

بعد ذلك، قم بتطبيق إجهاد ثنائي المحور متساوٍ (EQU biaxial strain) على الأغشية. ويختلف نظام الإجهاد بناءً على محاكاة القوى الميكانيكية داخل الجسم الحي. وكما ورد في البروتوكول المكتوب، يتم استزراع الخلايا على أغشية غير ممددة (non-ST stretched membranes).

تُستخدم المزارع التي يتم استزراعها بالتوازي كمجموعات ضابطة للتجربة. وفي نهاية التجربة، يمكن معالجة الطبقات أحادية الخلية لتحليل التغيرات في التعبير الجيني بواسطة real-time PCR أو التغيرات في وفرة البروتين بواسطة western blot. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تثبيت الطبقات أحادية الخلية لإجراء تجارب الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام هذه التقنية.

بعد التثبيت، تُقطع الأغشية من الأطباق وتُثبت على شرائح زجاجية باستخدام 10 إلى 20 µL من الماء كعامل تثبيت قبل عملية النفاذية والتحضين مع الأجسام المضادة. كما يمكن استخدام الرشاحة الناتجة من التجربة لاستقصاء وجود المواد المُفرزة مثل عوامل النمو أو السيتوكينات. تُظهر هذه الصورة خلايا ظهارية من النوع الثاني من جنين في اليوم E 18 مثبتة بالبارافورمالدهيد، والتي تم عزلها وفقاً لهذا البروتوكول وزراعتها في أطباق BioFlex المطلية باللامينين.

تم تثبيت الخلايا والتقاط الصورة. وفي اليوم التالي لعدم تعرض الخلايا لتمطط ST، تم زراعتها. وقد تم تحديد نقاء الخلايا بنسبة 90 ± 5% عن طريق التحليل المجهري لمورفولوجيا الخلايا الظهارية والصبغ المناعي لبروتين surfactant protein C. وتعرض الأشكال التالية بيانات من خلايا ظهارية جنينية من النوع الثاني تم تعريضها لإجهاد دوري بنسبة 5% بمعدل 40 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.

يوضح تحليل لطخة نورن (northern blot) للتعبير عن mRNA لبروتين السورفاكتانت C أن الإجهاد الميكانيكي يحفز تمايز الخلايا من النوع الثاني باستخدام ركائز مختلفة من المصفوفة خارج الخلية (ECM). وتمثل علامتا الزائد والناقص التعرض للإجهاد أو عدم التعرض له على التوالي. وتُعرض بيانات التعبير في الرسم البياني كمتوسط زائد أو ناقص الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، حيث N تساوي ثلاثة، وتشير النجمة إلى قيمة P أقل من 0.05.

تُظهر صور الكيمياء المناعية الفلورية هذه مستويات بروتين surfactant protein C باللون الأخضر. وفي خلايا الجنين من النوع الثاني غير المعرضة للإجهاد الميكانيكي على اليسار والمعرضة للإجهاد الميكانيكي على اليمين، تم صبغ النوى بـ dapi، والذي يظهر باللون الأزرق. يحدد هذا المدرج التكراري كمية نتائج لطخة ويسترن من ثلاث تجارب، مما يوضح أن التمدد الميكانيكي يزيد من مستويات بروتين surfactant protein C.

في هذه التجربة، كانت قيمة N تساوي ثلاثة، وتشير النجمة إلى أن قيمة P أقل من 0.05. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع خلايا الرئة الجنينية وتعريضها للتمدد الميكانيكي.