والنظام التجريبي لدراسة Mechanotransduction في خلايا رئة الجنين

القوات الميكانيكية تلعب دورا أساسيا في نمو الرئة وإصابة الرئة. هنا، نحن تصف وسيلة لعزل القوارض نوع رئة الجنين الخلايا الظهارية الثاني والخلايا الليفية، ويعرضهم لتحفيز الميكانيكية باستخدام

الهدف من هذا الإجراء هو وصف نظام تجريبي لدراسة النقل الميكانيكي في خلايا الرئة الجنينية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترميز لوحات الثقافة ببروتينات مصفوفة خارج الخلية. ثم يتم عزل الخلايا الظهارية من النوع الثاني من رئة الفأر الجنيني ، تليها عزل الخلايا الليفية للفأر الجنيني.

تصف الخطوة الأخيرة نظاما في المختبر لتوفير التحفيز الميكانيكي لخلايا الرئة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر زيادة في تمايز الخلايا من النوع الثاني من خلال صور تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، واللطخة الغربية ، والكيمياء المناعية الفلورية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقل التنبيغ الميكانيكي ، مثل نمو رئة الجنين وإصابة الرئة.

الإجراء جوليان غو ، فني من مختبري بينما نعمل في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة ، يصنع 120 ميكروغراما من اللامينين مع 12 ملليلترا من البارد المعقم XPBS لكل لوحة. يمكن استخدام بروتينات مصفوفة أخرى خارج الخلية للطلاء. راجع البروتوكول المكتوب للحصول على التفاصيل ، ثم خذ صفيحة BioFlex غير المعالجة وأضف ملليلترين من المحلول الرقائقي إلى كل بئر إلى تركيز نهائي يبلغ ميكروغرامين لكل سنتيمتر مربع.

تأكد من تغطية الآبار بالكامل بالمحلول. قم بتغطية اللوحة بالكامل بغلاف بلاستيكي وضعها على سطح مستو في بيئة أربع درجات مئوية طوال الليل للسماح للصفائح بالامتصاص في قاع الآبار. يمكن تخزين الألواح المطلية في ظل هذه الظروف لمدة أسبوع على الأقل مع الاحتفاظ بوظيفة ECM الجيدة في اليوم التالي.

في ظل ظروف معقمة ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد. ثم أضف ملليلتر واحد من 1٪ BSA في XPBS واحد لكل منهما. احتضان جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لمنع مواقع الربط غير المحددة على الأغشية.

ثم مرة أخرى ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد. لإزالة البروتينات غير الممتصة ، أضف ملليلتر واحد من DMEM إلى كل بئر من اللوحة. ثم قم بتخزين اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم عزل خليتين ظهاريتين من نوع رئة القوارض الجنينية وجاهزة للطلاء.

في اليوم السابق لبدء إجراء عزل الخلايا ، قم بتجميع أكواب الشاشة بشبكات نايلون 130 و 15 ميكرون وتعقيمها عن طريق التعقيم. أيضا الأوتوكلاف نفس العدد من قمم الزجاج 150 ملليلتر في يوم الثقافة. الحصول على رئتي الجنين من الفأر الحامل في الوقت المناسب على E 17 إلى 19 من الحمل.

انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر يحتوي على وسط DMEA وضعه على الثلج. اصنع عازلة هضم جديدة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وفقا للوصفة الواردة في البروتوكول المكتوب. وأثناء العمل في فلتر غطاء التدفق الرقائقي ، قم بتعقيمه من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.

10 ملليلتر من هذا المخزن المؤقت يكفي لأنسجة الرئة التي تم الحصول عليها من حوالي 20 جنينا من الفأر. ضع الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عازلة الهضم في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. قم بتقطيع الديوم من الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على أنسجة رئة الجنين وانقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم باستخدام مقص معقم أو شفرة حلاقة ، وقم بفرم الأنسجة إلى قطع يقل حجمها عن ملليمتر واحد.

ثم انقل الأنسجة إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عازلة الهضم الدافئة. بعد ذلك ، ساعد ميكانيكيا على هضم الأنسجة عن طريق سحب تعليق خلايا الرئة الجنينية لأعلى ولأسفل مائة مرة لكل منها باستخدام ماصات ذات حجم فتحة متناقص. بعد اكتمال عملية الهضم ، قم بالطرد المركزي المتجانس عند 1 ، 300 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة الاستلقاء بعناية عن طريق الشفط وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على الخلايا في 15 مل من DMEM بالإضافة إلى 20٪ FBS. بعد ذلك ، استرجع أكواب الشاشة بشبكات نايلون 130 و 15 ميكرون وضعها فوق أكواب معقمة سعة 150 مل. تتجانس الماصة الخلية على شبكة 100 ميكرون.

اجمع المرشح وقم بتثبيته على شبكة 30 ميكرون. اغسل شبكة 30 ميكرون عدة مرات باستخدام DMEM الطازج بالإضافة إلى 10٪ FBS. تتكتل معظم الخلايا من النوع الثاني معا ولا تمر عبر الشبكة.

تزيل هذه الغسالات الخلايا غير الظهارية التي قد تلتصق بالكتل. ضع المرشح من شبكة 30 ميكرون على كوب الشاشة الشبكي 15 ميكرون. مرة أخرى ، اغسل عدة مرات كما كان من قبل.

تقوم هذه الخطوة بتجنيد الخلايا من النوع الثاني التي ربما تكون قد مرت عبر شبكة 30 ميكرون. اجمع الخلايا غير المصفاة المتكتلة من الشبكات 30 و 15 ميكرون لمزيد من التخصيب للخلايا من النوع الثاني. احتفظ بالمرشح من شبكة 15 ميكرون إذا كان سيتم زراعة الخلايا الليفية الرئوية للقوارض الجنينية.

خلاف ذلك ، تجاهل هذا الترشيح. مزيد. قم بتنقية مجموعة الخلايا الظهارية من النوع الثاني عن طريق إضافة الوسائط واحتضان الخلايا غير المفلترة من أكواب شبكية 30 و 15 ميكرون في قارورة زراعة الأنسجة بحجم 75 سم مربع لمدة 30 دقيقة بعد جهاز الطرد المركزي هذا للحضانة الاسم الفائق كما كان من قبل ، قم بإعادة تعليق الحبيبات في ملليلترين من ماصة الجنين الخالية من المصل DMEM pro ماصة واحدة من تعليق الخلية في كل بئر من المغلفة الخشبية BioFlex ستة ألواح آبار في هذه المرحلة ، تظهر الخلايا في كتل عند ملاحظتها تحت المجهر ، وتحتضن اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تعتبر الحضانة لمدة 24 ساعة مثالية ويلزم حضانة لمدة ست ساعات على الأقل.

قبل البدء في تجارب الإجهاد الميكانيكي ، خذ المرشح من شبكة 15 ميكرون وانقله إلى قارورة زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 75 سم مربع عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة للسماح للأرومات الليفية بالالتصاق والشفط والتخلص منها. ثم استبدل الحجم الموجود في القارورة ب DMEM الخالي من المصل واحتضنه طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا التي تحتوي على 0.25٪ من التربسين في 0.4 مللي مولار EDTA وقم بوضعها على ألواح BioFlex المطلية بالفيبرونيكتين في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، من الناحية المثالية لمدة 24 ساعة قبل بدء تجارب الإجهاد الميكانيكي.

مطلوب حضانة لمدة ست ساعات على الأقل إذا كان هناك حاجة إلى عدد محدد من الخلايا للتجارب. يتم الحفاظ على الخلايا من النوع الثاني في قوارير خالية من المصل DMEM 75 سنتيمترا مربعا بعد العزل ، وفي اليوم التالي يتم عد الخلايا ، ثم يجب ألا تزيد الطبقة الأحادية عن 80٪ قبل بدء التجارب. في يوم تجربة التحفيز الميكانيكي ، يتم استبدال وسائط زراعة الخلايا بملليلترين من DMEM الطازج الخالي من المصل لكل بئر ، ثم يتم تركيب اللوحة في وحدة سلالة FX 5 ، 000 ذات خلية مرنة.

بعد ذلك ، قم بتطبيق سلالة EQU ثنائية المحور على الأغشية. يختلف نظام الإجهاد اعتمادا على محاكاة القوى الميكانيكية في الجسم الحي. كما تمت مناقشته في البروتوكول المكتوب ، نمت الخلايا على أغشية ممتدة غير ST.

يتم استخدام المستزرعة بالتوازي كعناصر تحكم للتجربة. في نهاية التجربة ، يمكن معالجة الطبقات الأحادية لتحليل التغيرات في التعبير الجيني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أو التغيرات في وفرة البروتين بواسطة اللطخة الغربية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إصلاح الطبقات الأحادية لتجارب الكيمياء المناعية لهذه التقنية.

بعد التثبيت ، يتم قطع الأغشية المرنة من الألواح وتثبيتها على شرائح زجاجية باستخدام 10 إلى 20 ميكرولترا من الماء كعامل تركيب قبل الاختراق والحضانة بالأجسام المضادة. يمكن أيضا استخدام السوبر داتين من التجربة للتحقيق في وجود مواد تم إطلاقها مثل عوامل النمو أو السيتوكينات. تظهر هذه الصورة الخلايا الظهارية من النوع الجنيني E 18 الثابتة التي تم عزلها كما في هذا البروتوكول ومطلية على ألواح BioFlex المشفرة بالصفيحة.

تم إصلاح الزنازين والتقاط الصورة. في اليوم التالي بعد أن تم طلاء الخلايا الممتدة غير ST. تم تحديد نقاء الخلايا ليكون 90 زائد أو ناقص 5٪ من خلال التحليل المجهري لمورفولوجيا الخلايا الظهارية والتلوين المناعي للبروتين الخافض للتوتر السطحي C. تقدم الأرقام التالية بيانات من الخلايا الظهارية من النوع الثاني للجنين التي تعرضت لسلالة دورية بنسبة 5٪ في 40 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.

توضح هذه اللطخة الشمالية للبروتين الخافض للتوتر السطحي C تعبير mRNA أن السلالة تحفز تمايز الخلايا من النوع الثاني باستخدام ركائز ECM مختلفة. تمثل علامات الطرح الزائد التعرض للإجهاد أو عدم التعرض للإجهاد على التوالي. يتم تقديم بيانات التعبير في الرسم البياني على أنها متوسط زائد أو ناقص SEM ، و N يساوي ثلاثة ، وتشير العلامة النجمية إلى قيمة P أقل من 0.05.

تظهر صور الكيمياء المناعية الفلورية مستويات بروتين الفاعل بالسطح C باللون الأخضر. في النوع الجنيني ، كانت الخلايا الثانية غير المعرضة للإجهاد الميكانيكي على اليسار والمعرضة للضغط الميكانيكي على النوى اليمنى مع دابي ، الذي يظهر باللون الأزرق. يحدد هذا الرسم البياني نتائج اللطخة الغربية من ثلاث تجارب تظهر أن التمدد الميكانيكي يزيد من مستويات بروتين البروتين C الخافض للتوتر السطحي.

في هذه التجربة ، N يساوي ثلاثة وتشير العلامة النجمية إلى قيمة P أقل من 0.05. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسريع خلايا الرئة الجنينية وتعريضها للتمدد الميكانيكي.