تعديل الخميرة اثنين والهجين نظام لتحديد البروتينات التفاعل مع عامل النمو Progranulin

يعمل نظام MY two H هذا على تحسين بروتوكول التهجين الثنائي التقليدي للخميرة لتقليل عدد النتائج الإيجابية الكاذبة بشكل ملحوظ. أولاً، قم بإجراء عملية تحويل صغيرة النطاق لبلازميد الطعم إلى الخميرة. وبعد التحقق من صحة بناء الطعم باستخدام فحص المثبط التنافسي، قم بفحص مكتبة cDNA على أطباق ناقصة لأربعة مكونات (minus four plates).

باشر بالتحقق من المستنسخات الإيجابية باستخدام مقاييس XGL والتفاعل. ثم حدد البروتينات المتفاعلة المحتملة عن طريق تسلسل DNA وتحليل المعلوماتية الحيوية. وفي النهاية، فإن نظام الخميرة ثنائي الهجين المعدل هذا يزيد بشكل كبير من كفاءة ونجاح عملية الفرز.

يشتهر نظام التهجين الثنائي التقليدي للخميرة بتوليد نتائج إيجابية كاذبة. يوضح هذا المقطع إجراء الفحص المعدل الذي تم تحسينه بشكل كبير لصالح تحديد التفاعلات الثنائية الحقيقية. لذا، لنبدأ الآن.

قم بتلقيح 50 ملليلتر من وسط YPD باستخدام خمسة ملليلتر من مزرعة MAV 2 0 3 التي نمت طوال الليل. اتركها لتنمو لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. ثم قم بحصاد الخميرة عن طريق الطرد المركزي، وبعد غسلة واحدة، أعد تعليق الرواسب في ملليلترين من المحلول واحد واحضرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

قم بتحضير مزيج DNA للتحول. أضف 100 µL من خلايا الخميرة وامزج جيداً. ثم أضف 700 µL من المحلول الثاني وامزج جيداً.

تُحضن العينات أولاً عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يتم إجراء صدمة حرارية. يتم الآن حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الراسب في 200 µL من الماء المقطر بالأتوكلاف، ثم تُنشر تخفيفات تسلسلية من المعلق على أطباق SD LU وتُحضن عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. تؤكد هذه الخطوة أن بلازميد الطعم ينشط عملية النسخ، وأن هذا التنشيط الذاتي يمكن تحييده بواسطة المثبطات مثل 3-AT، وهو مثبط تنافسي لناتج جين his3.

أولاً، قم بتحويل بلازميد الطعم إلى خميرة MAV 2 0 3. انشر ناتج التفاعل على أطباق SD LU واحضنها عند 30 درجة مئوية. ومن أجل فحص المستعمرات للكشف عن التنشيط الذاتي المستحث بـ three at، استخدم أعواد أسنان معقمة بجهاز التعقيم (autoclave) لنقل المستعمرات من كل عملية تحويل إلى أطباق SD LU hiss تحتوي على تركيزات متزايدة من three at، ثم احضن الأطباق عند 30 درجة مئوية.

استبعد سلالات الطُعم التي تنمو على أطباق تحتوي على 100 millimolar من three at باعتبارها غير مناسبة للاستخدام في فحص two hybrid لـ re. بالنسبة لسلالات الطُعم المتبقية، اختر أدنى تركيز من three at يثبط نمو الخلايا لاستخدامه في فحص CD NA library، ثم علّق عدة مستعمرات معزولة من الخميرة التي تحتوي على بلازميد الطُعم في 100 µL من الماء المقطر والمعقم بجهاز autoclave. قم بنشرها على طبقين من SD LU بقطر 10 cm.

يتم تحضين كلا الطبقين عند 30 درجة Celsius. تُكشط الخلايا وتُعلّق تماماً في 10 milliliters. يتم تعقيم الماء المقطر بجهاز الأوتوكلاف وتلقيح 500 milliliters من وسط YPD السائل.

تحقق من كثافة الخلايا باستخدام التحليل الطيفي والقياس الضوئي والزراعة عند 30 °C. باشر بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. اغسل الخلايا مرة واحدة في 100 mL من الماء المقطر والمعقم بجهاز الأوتوكلاف، ومرة واحدة في 50 mL من المحلول واحد.

بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في 2.5 milliliters من المحلول واحد. الآن أضف DNA sperm salmon المقطع والمنزوع من الطبيعة، وكذلك مكتبة cDNA مع الخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة. ثم أضف 15 milliliters من المحلول اثنين الذي يحتوي على 40% polyethylene glycol.

اخلط بلطف ووزع حصصاً بحجم 700 µL في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL قابلة للتعقيم بالأتوكلاف، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C، تليها صدمة حرارية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C.

احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليق كل راسب بلطف في 400 µL من الماء المقطر والمعقم بجهاز الأوتوكلاف. وزع كل خليط تحويل على طبقين اختياريتين واحضنهما لمدة تتراوح من 5 إلى 10 أيام عند 30 °C لتقدير رقابي لكفاءة التحويل في طبق التفاعل. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة لتفاعل واحد.

بعد التحضين لمدة ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية، حدد العدد الإجمالي للمستعمرات. انقل المستعمرات إلى طبق YPD وحضنها عند 30 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، ضع غشاء نيتروسليلوز مستديرًا مباشرة على طبق YPD، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية.

بعد دقيقة واحدة، تحقق من نقل جميع المستعمرات إلى الأغشية. ضع الغشاء بحيث يكون جانب المستعمرات للأعلى في قارب من رقائق الألومنيوم، ثم وضعه على سطح النيتروجين السائل لمدة 20 ثانية. بعد ذلك، اغمره في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين.

قم الآن بإزالة الغشاء لإذابته. وفي هذه الأثناء، جهز طبق بتري بوضع طبقة من محلول XCA الطازج فوق ورقة Whatman. ثم اغمر الغشاء المذاب بعناية واحضنه عند 37 درجة Celsius.

حتى تظهر مستعمرات زرقاء. ويمكن أن يؤدي دمج الفريسة والمستنسخات والطعم في الخميرة إلى استبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة بشكل أكبر. أولاً، قم بعزل الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) من سلالات الخميرة التي يحتمل أن تحتوي على بروتينات متفاعلة.

قم بتحويل DNA إلى بكتيريا e coli DH five alpha واختر المستعمرات عن طريق النمو على أطباق LB ampicillin. افحص المتحولات عن طريق تحليل إنزيمات التقييد. الآن قم بالتحويل المشترك لبلازميدات prey و bait إلى خميرة MAV 2 0 3 في أطباق SC LU trip واحضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية.

اختر ثلاث مستعمرات مختلفة لإجراء تسلسل مقايسة xal، والحمض النووي البلازميدي من النسائل الإيجابية وتحديد الجينات باستخدام المعلوماتية الحيوية. في هذه التجربة، استُخدم عامل النمو Rine pro Granulin كطعم لفحص مكتبة CD NA للدماغ و54 نسيلة إيجابية.

تم عزل المرشحين من بين 2.5 مليون من المحولات التي فُحصت باستخدام طعم pro granulin. وأشارت التحليلات الإضافية بواسطة مقايسة ex skull إلى وجود 23 مرشحاً إيجابياً من النسائل لطعم pro granulin.

ومن المثير للاهتمام أن التحليلات المعلوماتية الحيوية لبيانات التسلسل حددت TNF R two. وبالفعل، فقد أكدت التجارب الوظيفية الإضافية أن progranulin يمثل ربيطة جديدة لمستقبلات TNF. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء هذا الفحص الهجين المعدل باستخدام البروتين الذي يهمك.

لا تنسَ ارتداء القفازات أثناء العمل لأن بعض المواد المستخدمة قد تكون خطرة. بالتوفيق في تجاربك.