عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على تحضير عالي النقاء للخلايا الشجيرية من رئة الفأر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع أنسجة الرئة دون تضمين العقد اللمفاوية الصارفة، ثم الحصول على معلق خلوي أحادي عن طريق الهضم باستخدام إنزيم الكولاجيناز.

تتمثل الخطوة التالية في إثراء الخلايا الموجبة لـ CD 11 C باستخدام نظام عزل الخلايا المغناطيسي. والآن، يتم عزل المجموعة الفرعية للخلايا الشجيرية التقليدية عن طريق فرز الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. وفي النهاية، يمكن تحليل الخلايا الشجيرية التقليدية المعزولة من أنسجة رئة الفأر بواسطة قياس التدفق الخلوي والمجهر الضوئي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة، مثل ما هو دور المجموعة الفرعية للخلايا الشجيرية التقليدية في المناعة الفطرية والأمراض المعدية في الجهاز التنفسي؟ سيقوم بشرح الإجراء إيسا لانسيلين، وهو باحث مشارك من مختبري، وأنا أيضاً. بعد قتل الفأر رحمةً، ابدأ بالقص ثم سحب الجلد الخارجي للبريتون برفق لتعريض التجويف الصدري.

باشر بفتح الحجاب الحاجز عن طريق قطع القفص الصدري للكشف عن كل من القلب والرئتين. وبمجرد ظهور القلب والرئة، يمكن البدء في إجراء التروية. املأ سرنجة سعة 5 mL بمحلول E-D-T-A-H-B-S-S وقم بتوصيل إبرة مقاس 25 gauge بالسرنجة.

بعد ذلك، أدخل الإبرة في البطين الأيمن لمنع التسرب أثناء الحقن. استخدم الملاقط لتثبيت نسيج عضلة القلب حول الإبرة. ثم احقن المحلول برفق مع الحفاظ على ضغط ثابت.

سيؤدي التروية الدقيقة إلى انتفاخ الرئة وتغير لونها إلى الوردي أو الأبيض؛ ولتجنب التلوث المحتمل، قم بإزالة العقد الليمفاوية التصريفية والتخلص منها. بعد ذلك، اجمع أنسجة الرئة، مع نقل العضو المستأصل إلى طبق بتري على الثلج. املأ أنبوب gentle max C بخمسة مليليترات من محلول هضم كولاجيناز الرئة، ثم قطع الرئة إلى قطع صغيرة.

باستخدام شفرة حلاقة، انقل النسيج إلى الأنبوب مع مراعاة التفكيك الأقصى برفق. وللحصول على معلق خلوي أحادي، اختر البرنامج M lung zero one. ثم حضن العينة عند 37 °C لمدة 30 دقيقة، مع رج الأنبوب كل خمس دقائق لإعادة تعليق شظايا النسيج F، ثم تابع تنفيذ البرنامج M lung zero two.

انقل العينة الآن إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وقم بطرد الخلايا مركزياً لمدة 10 minutes بسرعة 335 ×g عند درجة حرارة 4 °C. تخلص من السائل الطافي وأضف 2 milliliters من محلول CK lysing buffer إلى الراسب لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتحليل ما تبقى من خلايا الدم الحمراء. بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام 13 milliliters من محلول PBS البارد المكمل بـ 0.5%BSA.

بعد التخلص من السائل الطافي، أعد تعليق هذه الراسبة مرة أخرى في خمسة ملليلترات من محلول PBS البارد مضافاً إليه BSA، ثم مرر محلول الخلايا عبر شبكة نايلون بمسام حجمها 100 ميكرومتر. وأخيراً، حدد العدد الإجمالي للخلايا باستخدام طريقة استبعاد صبغة tripan blue. وبدلاً من استخدام جهاز gentle max dissociation، املأ أنبوباً مخروطياً سعة 15 ملليلتر بخمسة ملليلترات من محلول collagenase لكل رئة.

أضف أنسجة الرئة المقطعة إلى الأنبوب، وحضّن أنسجة الرئة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم برج الخلايا بجهاز vortext كل 15 دقيقة من أجل إعادة توزيع قطع الأنسجة. بعد ذلك، قم بتفتيت الأنسجة الهضمية عن طريق تمرير العينة من ست إلى ثماني مرات عبر سرنجة سعة 3 ml متصلة بإبرة مقاس 20 gauge.

تجنب تكوين الفقاعات أثناء العملية. أولاً، يتم غسل معلق الخلايا المفردة لمدة 10 دقائق عند 200 ×g في درجة حرارة 4 °C والتخلص من supernatant. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الخلايا في 400 µL من محلول الفصل المنظم.

قم بمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة بواسطة مستقبلات FC في إجمالي الخلايا الثماني باستخدام 0.5 micrograms من الجسم المضاد anti CD 1632، واحضن الخلايا الست لمدة 30 minutes عند درجة حرارة 4 °C. بعد غسل الخلايا باستخدام 10 milliliters من منظم الفصل البارد، أعد تعليق الخلايا في 400 µL من منظم الفصل. ثم أضف 100 µL من حبيبات CD 11 C الدقيقة، إلى إجمالي الخلايا الثماني، وامزج جيداً، ثم احضن محلول الخلايا والحبيبات لمدة 15 minutes في الثلاجة.

بعد إزالة الخرزات غير المرتبطة باستخدام 10 milliliters من منظم الفصل البارد، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في one milliliter من منظم الفصل البارد. وأخيراً، قم بتحميل العينات في جهاز الفصل AutoMax pro وقم بتشغيل برنامج P-O-S-S-E-L-D لجمع جزء الخلايا التي تعبر عن CD 11 C.

يتم تحضين معلق الخلايا الإيجابية لـ CD 11 C المُكثفة مع أجسام مضادة anti CD 11 C PEI 7 وأجسام مضادة موجهة ضد جزيئات MHC Class Two الموجودة على هذه الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS plus BSA البارد، يتم إعادة تعليق الخلايا في 0.5 milliliters من PBS plus BSA، ثم تمريرها عبر مرشح شبكي نايلون بمسامية 40 micrometer. وأخيراً، تُضاف خلايا CD 11 C الإيجابية المنقاة إلى أنبوب fax من أجل التقدير الكمي لاحقاً في أنابيب فارغة منفصلة.

أضف 100 µL من PBS بالإضافة إلى BSA إلى أنابيب تجميع سعة خمسة ملليلتر لمنع تضرر الخلايا المنقاة، ثم قم بفرز معلق الخلايا المُرشح وفقاً للخصائص المطلوبة، مع الحفاظ على الخلايا التي تم جمعها في درجة حرارة مبردة طوال عملية فرز الخلايا. في مخططات الكثافة هذه، يوجد في الطحال عدد من الخلايا التغصنية التقليدية يزيد عن ثلاثة أضعاف عددها في الرئة. وعلاوة على ذلك، تشمل الخلايا الموجبة لـ CD 11 C في الرئة مجموعة من الخلايا التي ليست خلايا تغصنية تقليدية، وهو ما تمثله مجموعة الأحداث ذات التعبير المنخفض عن MHC Class two خارج بوابة الخلايا التغصنية التقليدية.

في الجانب الأيسر من الشكل كما يظهر في مخطط الكثافة هذا، يؤدي الفصل المغناطيسي لخلايا الرئة الكلية لـ CD 11 C إلى زيادة أعداد الخلايا الشجرية التقليدية من حوالي 1.5% من إجمالي الخلايا إلى حوالي 16.5%. ومع ذلك، لا تزال البلاعم ذات التعبير المنخفض عن MHC Class two والموجبة لـ CD 11 C تشكل أكثر من 70% من إجمالي مجتمع الخلايا، مما يلوث بشكل كبير نقاء المجموعة الفرعية المخصبة من الخلايا الشجرية التقليدية في الرئة في هذه المرحلة من عملية العزل. أما الفرز بواسطة FACS، فيعمل على تعزيز نقاء الخلايا الشجرية التقليدية إلى أكثر من 96% كما يظهر في الصورة المجهرية أعلى اليمين. وتظهر الخلايا الشجرية التقليدية ذات التعبير العالي عن CD 11 C والتعبير العالي عن MHC Class two كخلايا مستديرة تحمل الزوائد الشجرية النموذجية، بينما تظهر الخلايا ذات التعبير العالي عن CD 11 C والتعبير المنخفض عن MHC class two الموضحة في الصورة المجهرية أسفل اليمين نتوءات خلوية أكثر نموذجية لمورفولوجيا البلاعم.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع أنسجة الرئة وتحضير الخلايا المفردة في درجات الحرارة المحددة؛ حيث يعد ذلك أمراً بالغ الأهمية للحفاظ على حيوية الخلايا وإنتاجية الخلايا التغصنية التقليدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعات الخلايا التغصنية الفرعية من رئة الفأر.

يمثل عزل المجموعات الفرعية للخلايا التغصنية الرئوية أداة مفيدة جدًا لاكتساب رؤى حول وظائف هذه الخلايا استجابةً لمسببات الأمراض التنفسية والعوامل البيئية التي يمكن أن تحفز الاستجابة المناعية للعائل في الرئة.