قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

لقياس كمية انتقال الببتيد عبر أغشية الحويصلات. يتم إنتاج حويصلات دهنية مُوسومة فلورياً مع تغليف التربسين بداخلها. يُضاف مثبط للتربسين لتثبيط نشاط أي تربسين خارجي، مما يترك التربسين النشط داخل تجويف الحويصلة.

فقط عند إضافة الببتيدات الموّسمة فلورياً إلى الحويصلات، تعمل علاماتها الفلورية كمانحات لـ fret وتعمل على إثارة الجزيئات الفلورية الموجودة على الحويصلة. ومع ذلك، عندما تعبر البروتينات الغشاء، يتم هضمها بواسطة trypsin وتُفقد إشارة fret. ويكشف التحليل الطيفي عن مدى انتقال الببتيد، والذي يظهر على شكل انخفاض في fret بين الحويصلات والببتيد بمرور الوقت.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، بما في ذلك تقنيات الحويصلات الدهنية الأخرى وطرق قياس دخول الببتيدات إلى الخلايا، في أنها توفر معلومات حول حركية دخول الغشاء، ولا تتطلب إضافة علامة فلورية إلى الببتيدات إذا كانت تحتوي على tryptophan. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في تصميم وهندسة الببتيدات النشطة غشائياً، مثل الخصائص الضرورية للنقل الغشائي الفعال. تتمثل الخطوة الأولى من هذا الإجراء في تحضير حويصلات دهنية أحادية الطبقة كبيرة أو UUVs لتعمل كمحاكيات لغشاء الخلية في المقايسة.

ابدأ بخلط الفوسفاتيديل كولين، والفوسفاتيديل، والغليسرول، وخمسة ثنائي ميثيل أمينو نفتالين. واحد سلفو فلسفاتيديل إيثانولامين في الكلوروفورم. بنسبة 50 إلى 45 إلى خمسة، وعادةً ما تكون كمية 0.376 mg من إجمالي الدهون كافية لتحضير عدد كافٍ من الحويصلات لتجربة واحدة أو عينة ضابطة واحدة.

قم بتحضير أنبوب واحد كعينة تجريبية وأنبوب آخر كعينة ضابطة، ثم بخر الكلوروفورم باستخدام تيار من غاز النيتروجين. تُسمى الدهون المجففة المتبقية بعد هذه الخطوة بكتل الدهون (lipid cakes). جفف كتل الدهون لمدة تتراوح بين 9 إلى 14 ساعة في مجفف تفريغ.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون من HEI بتركيز 10 millimolar، ومحلول مخزون من تريبسين الخنزير بتركيز 0.4 millimolar، ومحلول مخزون من مثبط التريبسين Bowman Burke بتركيز 4.0 millimolar؛ ويمكن العثور على تفاصيل التحضير في المستند المرفق. أضف حجماً متساوياً من مخزون التريبسين بتركيز 0.4 millimolar ومحلول منظم heis بتركيز 10 millimolar إلى كعكات الدهون المجففة. ثم قم برج الأنبوب بجهاز الفورتكس لإعادة تشكيل الحويصلات متعددة الطبقات أو mvs. ولإعادة تشكيل mvs الضابطة، أضف حجماً متساوياً من مخزون التريبسين بتركيز 0.4 millimolar ومثبط التريبسين بتركيز 4.0 millimolar إلى كعكة الدهون المجففة، ثم رجها بجهاز الفورتكس كما سبق.

بمجرد إعادة تشكيل الحويصلات متعددة الطبقات (mvs)، انقل محاليل الحويصلات متعددة الطبقات (MLV) من القنينات الزجاجية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 milliliter. بعد ذلك، أخضع محاليل MLV لخمس دورات من التجميد والإذابة، بالتناوب بين النيتروجين السائل وحمام مائي بدرجة حرارة 30 degree Celsius. بعد ذلك، قم بتجهيز جهاز بثق الدهون عن طريق ترطيب دعامتين للترشيح في Heiss Buffer.

ثم ضع كلًا منها على قطعة بثق من التفلون المبللة، وضع غشاءً محفوراً بمسارات النوى ذات مسام بحجم 0.1 micron بين قطعتي البثق من التفلون. الآن ضع قطع البثق داخل علبة بثق معدنية وضع فاصلًا حلقياً فوق قطعتي البثق. أحكم إغلاق الجزء العلوي المعدني لعلبة البثق، ثم ضعها في الحامل باستخدام حقنة زجاجية سعة 250 microliter.

املأ فراغ الباثق بـ 500 µL من محلول منظم HEPES بتركيز 10 mM لمنع أي فقد في عينة الحويصلات. انقل العينة إلى بيكر سعة 10 mL.

بعد ذلك، ضع كل عينة من MLV في البثق (extruder) وادفع العينة عبر الغشاء 21 مرة على الأقل. ولضمان الحصول على حجم موحد لحويصلات Ella بعد عملية البثق، انقل حويصلات ELLA الدهنية الكبيرة أو L UUVs إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 milliliter. تُحفظ UUVs عند درجة حرارة 4 °C وتُستخدم خلال 48 ساعة.

لتقييم تركيز LUV، يتم تحديد محتوى الفوسفور الكلي في العينة. يجب تحضير المواد التالية وفقاً للمواصفات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق: H₂SO₄ بتركيز 8.9 normal، وموليبدات الأمونيوم بتركيز 2.5%weight per volume، وحمض الأسكوربيك بتركيز 10%weight per volume، ومحلول منظم الفوسفات بتركيز 0.65 millimolar.

قم بتحضير ستة معايير للفوسفور كما هو موضح هنا. ثم قم بتحضير عينة فارغة (blank) من LUV باستخدام نفس الحجم من محلول trypsin بتركيز 0.2 millimolar ومحلول Bowman BIR inhibitor بتركيز 2.0 millimolar المستخدم في العينات الضابطة. يتم القيام بذلك لتصحيح أي أملاح فوسفور مجففة قد تكون موجودة في مسحوق Bowman B inhibitor.

بعد ذلك، قم بنقل حوالي 0.1 micromoles (عادةً حوالي 25 µL) من UUVs باستخدام الماصة إلى أنابيب زراعة زجاجية مخصصة للاستخدام لمرة واحدة في ثلاث مكررات. بعد ذلك، أضف 450 µL من H₂SO₄ بتركيز 8.9 normal إلى كل من أنابيب العينات والمعايير والأنبوب الفارغ (blank). ثم ضع العينات والمعايير والأنابيب الفارغة في فرن درجة حرارته تتراوح بين 175 إلى 210 °C لمدة 25 دقيقة.

بعد مرور 25 دقيقة، أخرج جميع الأنابيب من الفرن واتركها لتبرد. أضف 150 µL من 30%H2O إلى كل أنبوب. ثم قم بتسخين العينات والمعايير والعينات الفارغة لمدة 30 دقيقة أخرى عند درجة حرارة تتراوح بين 175 إلى 210 °C.

بعد مرور 30 دقيقة، قم بإزالة معايير العينة والعينات الفارغة من مصدر الحرارة. إذا لم تصبح أي من المحاليل عديمة اللون بعد، أضف 50 µL من H2O إلى جميع الأنابيب وسخنها لمدة 15 دقيقة إضافية عند درجة حرارة تتراوح بين 175 إلى 210 °C. وبمجرد أن تصبح المحاليل عديمة اللون، أضف 3.9 mL من nano pure H2O و 0.5 mL من محلول ammonium moate و 0.5 mL من محلول ascorbic acid إلى كل أنبوب.

بعد ذلك، يتم تسخين جميع الأنابيب لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق في حمام مائي مغلي، ثم تُقاس امتصاصية كل معيار وعينة عند 820 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية Agilent 8 4 5 3. يجب قياس تركيزات LUV التجريبية والضابطة بشكل منفصل.

يجب استخدام الأنبوب الذي يحتوي على 0.0 millimoles من الفسفور كعينة فارغة (blank) لجميع المعايير وعينات LUV التجريبية. كما يجب استخدام الأنبوب الذي يحتوي على 0.2 millimolar من التربسين و 2.0 millimolar من محلول مثبط bone and bir كعينة فارغة لعينة LUV الضابطة. ويُستخدم منحنى المعايرة الخطي للامتصاص مقابل محتوى الفسفور الناتج لحساب إجمالي محتوى الفسفور وتركيز LUV في العينات.

لتحضير محاليل الببتيد، قم بإذابة الببتيد في Oppu H2O، ويجب أن تحتوي الببتيدات المستخدمة في هذا المقايسة على ثمالة تريبتوفان واحدة. قم بقياس امتصاصية محلول الببتيد عند 282 نانومتر في ثلاث مكررات. احسب تركيز الببتيد باستخدام معامل الامتصاص المولاري للتريبتوفان البالغ 5, 700.

قم بتخفيف الببتيد في ماء nano pure للوصول إلى تركيز نهائي قدره 30 micromolar، ثم يُحفظ عند درجة حرارة -20 °C. ولتقدير كمية الانتقال، قم بتحضير عينات تجريبية وعينات ضابطة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 milliliter. أضف كمية كافية من UUVs إلى كل محلول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 250 micromolar.

أضف كمية كافية من محلول Bowman BIR المثبط بحيث يكون التركيز النهائي للمثبط أكبر بـ 10 أضعاف من تركيز tryin. ثم أضف كمية كافية من محلول heis buffer بتركيز 10 millimolar ليصل الحجم النهائي للمحلول إلى 450 microliters. ضع 50 microliters من محلول الببتيد في خلية fluorimeter من نوع stana micro chords وضعها في جهاز spectrophotometer.

جهاز مطياف فلوري لإجراء تجربة حركية فلورية مدتها 25 دقيقة، يتم فيها تسجيل قراءة الفلورة مرة واحدة على الأقل في الثانية، بطول موجي للإثارة يبلغ 280 نانومتر وطول موجي للانبعاث يبلغ 525 نانومتر عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. مع ضبط حساسية أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) على الدرجة العالية، أضف العينة التجريبية أو عينة التحكم إلى محلول الببتيد في وعاء الكيوفيت (qve). يجب أن يؤدي ذلك إلى وصول التركيز النهائي للببتيد إلى 3 ميكرومولار، ثم ابدأ تجربة الحركية الفلورية على الفور.

بمجرد تشغيل كل من العينات التجريبية وعينات الضبط، احسب نسب الانتقال كما هو موضح في الوثيقة المرفقة. إن النسبة بين و الببتيد مرتفعة بما يكفي لضمان أن جميع الببتيدات السليمة تقريبًا موجودة على مسافة قريبة بما يكفي من مجموعة dansel لإعطاء إشارة fret، حتى لو لم ينتقل أي منها إلى الحويصلة. وهذا يتوافق مع إشارة fret المماثلة التي لوحظت في ظروف الضبط للببتيدات التي تنتقل والتي لا تنتقل إلى الحويصلات.

أُجريت اختبارات الانتقال كما هو موضح في هذا الفيديو. يوضح هذا الشكل النتائج المستمدة من ببتيد تمثيلي أظهر انتقالاً قوياً. وتُظهر الإشارة في هذه التجربة، والممثلة بالمنحنى الأسود، انخفاضاً ملحوظاً في إشارة fret.

بمرور الوقت، تشير نسب الانتقال الأعلى إلى الببتيدات التي تنتقل بكفاءة. تبلغ نسبة الانتقال للببتيدات النافذة إلى الخلايا الموضحة هنا 1.19، بينما تمتلك الببتيدات الضعيفة نسب انتقال أقرب إلى الواحد للتحكم في الفقد المحتمل لإشارة fret نتيجة لعدم اكتمال عملية الهضم بالتربسين أو التثبيط أو عوامل أخرى غير مرتبطة بالقدرة على الانتقال. يتم قياس إشارة fret بين الببتيد وUUVs التي تحتوي على كل من التربسين ومثبط التربسين Bowman BRK.

يظهر هذا في المنحنى الرمادي. وتبرز البيانات المعروضة هنا أهمية التجربة الضابطة باستخدام UUVs التي تحتوي على مثبط التربسين. وفي هذه الحالة، انخفضت إشارة الببتيد بمقدار مشابه لما ظهر في الشكل السابق في العينة التجريبية المتمثلة في المنحنى الأسود.

ومع ذلك، تظهر عينة الضبط انخفاضاً أكثر سرعة لهذا الببتيد، لذا فإن صافي انتقاله يكون أقل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحضير الحويصلات الدهنية وقياس انتقال الببتيدات التي تحتوي على التريبتوفان. عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر البدء في جمع البيانات مباشرة بعد خلط الببتيد والحويصلات.