Name: تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: اكتشف طريقة تغيير التعبير الجيني في خلايا B راموس باستخدام العدوى الفيروسية لقياس تأثيره على الطفرة الجسدية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد عوامل جديدة متورطة في تنوع الأجسام المضادة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وpMSCV - AID - I - Thy1.1 pKat2 وناقلات وهدية عينية من المديرية العامة للكاتس وpVSV - G ، pRSV رؤيا ، وpMDLg / pRRE ناقلات كانت هدية من نوع كولين BR.

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

كما نوقش سابقا ، وأصبحت نماذج خط الخلية لتنويع الضد نقطة انطلاق لتحديد شعبية رواية البروتينات التي تؤثر على خطوات مختلفة خلال تنويع الأضداد. نقدم هنا طريقة لاستخدام عدوى فيروسية للبروتينات إما إلى أسفل ، أو تدق overexpress في خط B - الخلية راموس ومن ثم دراسة تأثير ذلك على SHM. لهذه الدراسات ، ونحن نستخدم كل من راموس وWT AID الخلايا مرحبا راموس. ويمكن استخدام خلايا وزن لدراسة العوامل التي تدخل في استهدا...

ويمكن استبدال معظم هذه مع المنتجات المماثلة من الشركات الأخرى -- الكواشف المقترحة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th > شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td > 6 - TC جيدا واضحة لمعاملة لوحات </td><td > كورنينج </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 مل BD - Luer Loksyringes </td><td > دينار بحريني الطبية </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 - TC جيدا واضحة لمعاملة لوحات </td><td > كورنينج </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96 - جيدا واضحة البوليسترين مسطحة القاع TC المعاملة microplates </td><td > كورنينج </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 ملم الأطباق الثقافة TC المعالجة </td><td > كورنينج </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > مرشحات حقنة Acrodisc ، 0.45 ميكرون </td><td > بظلالها العلوم الحياتية </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > آغار </td><td > Teknova </td><td > A7777 </tد&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E - 3120 - 500 </td><td ></td></tr><tr><td > أمبيسيلين </td><td> سيغما </td><td > A0166 </td><td> 100 ملغ / مل في الماء </td></tr><tr><td > دينار بحريني تدفق الثاني FACSCanto عداد الكريات </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td ></td><td > أو ما شابه ذلك </td></tr><tr><td> دينار بحريني أسفل أنابيب الجولة فالكون البوليسترين </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td > 352054 </td><td > لFACS </td></tr><tr><td > 23 BOSC الخلايا </td><td > ATCC </td><td > CRL - 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 حاضنة قادرة على 37 درجة مئوية </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) </td><td > سيغما </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (مصل بقري جنيني) </td><td > الجوزاء المنتجات الحيوية </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α - الفئران CD90/mouse CD90.1 الأضداد </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα - Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE الكاشف ترنسفكأيشن 6 </td><td > روش </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES العازلة الحل </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > فاي كابا بوليميريز الحامض النووي </td><td > كابا النظم البيولوجية </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB الحساء (المرق lysogeny -- لوريا) مسحوق </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > بعثة TRC shRNA الأسهم الجلسرين البكتيرية </td><td > سيغما </td><td ></td><td> ناقلات shRNA </td></tr><tr><td > NCS (العجل الوليد المصل) </td><td > الجوزاء المنتجات الحيوية </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (الفوسفات حل مخزنة) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > المخفف في الماء ل1X </td></tr><tr><td > PE الضد α الغلوبولين المناعي البشري </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (البنسلين ، الستربتومايسين ، الجلوتامين الحل) </td><td > الجوزاء بيو - PRODUCTS </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine الميثيل) </td><td > سيغما </td><td > 107689 </td><td > 10 ملغ / مل في الماء </td></tr><tr><td > PureYield نظام Midiprep البلازميد </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما </td><td > P8833 </td><td > 250 ميكروغرام / مل في الماء </td></tr><tr><td > QIAquick هلام استخراج طقم </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> راموس (RA 1) الخلايا </td><td > ATCC </td><td > CRL - 1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI المتوسطة - 1640 </td><td > سيغما </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > مرتفع الثاني </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR طقم </td><td > كابا النظم البيولوجية </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > طق بوليميراز الدنا </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA استنساخ عدة </td><td > Invitroالجنرال </td><td > K4520 - 01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > المعالج الحمض النووي الجينوم SV تنقية النظام </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X - غال [5 - 4 - برومو كلورو - 3 - β - indoyl - D - galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C - 5687 </td><td > 40 ملغ / مل في DMSO </td></tr></tbody></table>

تقييم hypermutation الجسدية في خلايا b راموس بعد overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

خلايا B تبدأ حياتها مع الأجسام المضادة الناتجة عن انخفاض تقارب تأشب الخامس J (D). ومع ذلك ، بناء على الكشف عن العوامل المسببة للأمراض ، وتحور المتغير (V) المنطقة من الجين (IG) الغلوبولين المناعي ما يقرب من 100،000 مرات أكثر من بقية الجينوم خلال hypermutation جسدية (SHM) ، مما أدى إلى ارتفاع تقارب 1،2 الأضداد. بالإضافة إلى ذلك ، فئة التوحد التبديل (CSR) وتنتج الأجسام المضادة مع وظائف المستجيب مختلفة تبعا لنوع من رد الفعل المناعي ان هناك حاجة لعامل ممرض معين. وبدأ كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات والتي SHM نازعة أمين سيتيدين التنشيط التي يسببها (AID) ، والتي deaminates مخلفات السيتوزين في الحمض النووي لانتاج uracils. تتم معالجة هذه uracils بأشكال عرضة للخطأ من مسارات الإصلاح ، مما يؤدي في النهاية إلى حدوث طفرات وإعادة التركيب 1-3. فهمنا الحالي للتفاصيل الجزيئي للSHM والمسؤولية الاجتماعية للشركات تأتي من مجموعة من الدراسات التي أجريت في الفئران وخلايا الأولية ، وخطوط الخلية ، والخلية F -ري التجارب. نماذج الماوس تبقى المعيار الذهبي مع بالضربة القاضية الجينية تظهر أدوارا حاسمة لعوامل كثيرة إصلاح (على سبيل المثال اونغ ، MSH2 ، Msh6 ، Exo1 وبوليميريز η) 40-10. ومع ذلك ، ليس كل الجينات قابلة للدراسات خروج المغلوب. على سبيل المثال ، بالضربة القاضية من عدة مزدوج الجديلة البروتينات إصلاح كسر مميتة بشكل أولي أو يضعف B - الخلية التنمية 11-14. وعلاوة على ذلك ، قد تكون في بعض الأحيان ملثمين وظيفة معينة من البروتين في SHM أو المسؤولية الاجتماعية للشركات عن عيوب أكثر عالمية بسبب خروج المغلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن منذ التجارب على الفئران أن تكون طويلة ، وتغيير تعبير الجينات الفردية في خطوط الخلايا قد تصبح خطوة شعبية متزايدة الأولى لتحديد وتوصيف الجينات مرشح 15-18. وقد تم شعبية الخلية سطر نموذج لدراسة SHM 18-24 -- راموس -- خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت الخط الذي يمر constitutively SHM. ميزة واحدة من الخلايا راموس هو أن لديهم المدمج في شبه مريحةقياس كمي للSHM. خلايا التعبير عن نوع IgM و البرية ، لأنها تلتقط الطفرات ، وبعض من الطفرات ضرب التعبير الغلوبولين المناعي. لذلك ، يعاير خسارة الغلوبولين المناعي عن طريق المسح الضوئي مضان تنشيط الخلايا (FACS) يوفر قراءة سريعة التدريجي لمستوى SHM. ويمكن الحصول على مزيد من القياس الكمي للSHM بواسطة تسلسل الجينات مباشرة الأضداد. منذ الخلايا راموس يصعب transfect ، ونحن ننتج المشتقات المستقرة التي زادت أو خفضت التعبير عن الجينات الفردية التي تصيب الخلايا مع فيروسات أو يبني lentiviral التي تحتوي إما على كاسيت أو overexpression قصيرة الحمض النووي الريبي القاسي (shRNA) ، على التوالي. هنا ، نحن تصف كيف تصيب الخلايا راموس ومن ثم استخدام هذه الخلايا لبحث دور للجينات محددة بشأن SHM (الشكل 1).

نحن تصف كيفية تنفيذ فيروسات أو التهابات lentiviral من overexpression shRNA أو المحتوية. يبني الإنسان راموس في الخلية B الخط وكيفية قياس جسدية hypermutation في هذه الخلايا

تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة

تبدأ الخلايا البائية (B cells) حياتها بأجسام مضادة ذات ألفة منخفضة يتم توليدها عن طريق إعادة تشكيلة V(D)J. ومع ذلك، عند اكتشاف مسبّب للمرض، فإن المنطقة المتغيرة (V) لـ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تغيير التعبير عن جين معين ومن ثم قياس تأثير ذلك على الطفرات المفرطة الجسدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترانسفكشن خلايا Bosque 23 لإنتاج جسيمات فيروسية تحتوي إما على بنية مفرطة التعبير أو بنية تحتوي على SHRA. وكخطوة ثانية، يتم إيضفاء العدوى على خلايا ramo باستخدام هذه الفيروسات، مما يؤدي إما إلى تثبيط أو زيادة التعبير عن الجين المستهدف.بعد ذلك، يتم إنماء مستعمرات الخلايا الفردية لعدة أسابيع للسماح للخلايا بتراكم الطفرات. وفي النهاية، يمكن تحديد تأثير التعبير الجيني المتغير بناءً على تحليل فقدان IgM ومن خلال تسلسل جينات IG. قد تساعد هذه الطريقة في تحديد عوامل جديدة تشارك في تنويع الأجسام المضادة.ابدأ بصب 600 µL من وسط DMEM الدافئ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. ثم مع الحرص على الماصة مباشرة في الوسط، أضف 30 µL من FU gene six إلى الأنبوب، وقم برج المحلول باستخدام جهاز الفورتكس لأقل من ثانية واحدة، ثم حضّن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، بالنسبة للعدوى الفيروسية البطيئة مثل هذه الحالة، أضف 6 µg من بنية S-H-R-N-A و 1.5 µg من كل من P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E و PRSV rev إلى خليط DMEM و FU gene six.قم برج المحلول باستخدام جهاز الدوامة (Vortex) لفترة وجيزة، ثم حضن الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة مرة أخرى، وهذه المرة لمدة 25 دقيقة. وأخيراً، قم بنقل جين D-N-A-D-M-E-M FU إلى مستنبت خلايا Bosque 23 بكثافة تتراوح بين 50 و 60%. اخلط الخلايا ثم حضنها عند درجة حرارة 37 °C ونسبة 5% CO2 لمدة 24 ساعة.في اليوم التالي، أضف 5 mL من DMEM إلى الخلايا وأعدها إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. وفي اليوم الثالث بعد عملية عفن الخلايا (transfection)، استخدم محقنة سعة 10 mL لجمع 10 mL من الوسط من الخلايا المنقولة 23، ثم قم بتثبيت مرشح بمقاس 0.45 µm في طرف المحقنة. اجمع الوسط المرشح في أنبوب بولي بروبيلين نظيف سعة 15 mL. قبل 24 ساعة من العدوى، قم بزراعة 2 mL من خلايا ramo بتركيز 2 × 10⁵ خلايا/mL في وسط RPMI كامل في طبق سداسي الفجوات. وفي اليوم التالي، أضف 3 µL من محلول poly brain بتركيز 10 µg/mL، و 1 mL من الفيروس إلى خلايا ramo، ثم اخلط معلق الخلايا جيداً باستخدام الماصة.بالنسبة لعينة الضبط غير المصابة، أضف 1 mL من وسط RPMI الكامل و 3 µL من poly brain إلى إحدى الفتحات بدلاً من الفيروس. كما يجب إصابة فتحة أخرى بضابط سلبي مطابق، وفتحة أخرى بـ vector يحتوي على GFP لتحديد كفاءة الإصابة عبر تقنية fax. الآن، قم بطرد مركزي للصفيحة ذات الست فتحات بسرعة 3000 ×g لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد الصفيحة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.أخيرًا، قم بطرد الخلايا المصابة مركزياً في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 milliliter بسرعة 400 Gs لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اشفط الوسط مع التأكد من عدم تعريض طبقة الخلايا للاضطراب، وأعد تعليق الخلايا في وسط RPMI جديد. بعد عدّ الخلايا، قم بتخفيف كمية من خلايا ramo المصابة لتصل إلى 10 cells per milliliter.في محلول من وسط RPMI المكيّف وFBS ليصل الحجم النهائي إلى 10 ملليلتر لكل طبق مستزرع. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لاستزراع أطباق ذات 96 بئراً بوضع 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة في كل بئر.بعد تحضين الأطباق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون، استخدم المجهر لفحص كل بئر على حدة. وذلك للتأكد من وجود الخلايا، حيث يمكن أن يكون تحديد العمق المناسب لتمييز الخلايا المفردة أمراً صعباً. في البداية، حاول التركيز على أرقام الآبار المطبوعة في قاع طبق الـ 96 بئراً.ثم حاول البحث عن الخلايا بعد مرور أسبوعين. افحص وجود مستعمرات خلوية على طول حواف الآبار باستخدام حبر دائم. حدد الآبار التي تظهر نمواً خلوياً قوياً، ثم انقل المستعمرات إلى أطباق ذات 24 بئراً في 1 mL من وسط RPMI لمزيد من الحضن.بعد عدة أيام من النمو، انقل الخلايا إلى طبق ذي ستة آبار واستمر في تحضين المزارع. بعد ثلاثة أسابيع من استزراع المستعمرات الخلوية في الطبق ذي الستة آبار، انقل 5 × 10⁵ من الخلايا من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. وفي هذا الوقت، قم أيضاً بحصاد الخلايا من كل بئر من آبار التحكم وآبار تثبيط HRNA، بالإضافة إلى عينة واحدة لتكون بمثابة تحكم غير مصبوغ.الآن قم بطرد جميع الخلايا مركزياً عند 400 Gs لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع غسل الخلايا مرتين باستخدام 1 ml من PBS في عملية الطرد المركزية الثانية. بعد الغسلة الثانية، نقوم بتعليق ركازة مجموعة الضبط غير المصبوغة في 50 µL من PBS، وتعليق الركازات الأخرى في PBS مضافاً إليه تخفيف بنسبة 1:20 من الأجسام المضادة anti-human IGM الموسومة بـ PE. بعد ذلك، يتم تحضين جميع عينات الخلايا على الثلج لمدة ساعة واحدة، ثم تُغسل الخلايا مرتين إضافيتين باستخدام PBS كما سبق، ويُتخلص من الرائق ويُعاد تعليق جميع الركازات في 100 µL من PBS.بعد ذلك، انقل الخلايا المصبوغة والخلية الضابطة غير المصبوغة بعد إعادة تعليقها إلى أنابيب fax، ثم قم بتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي. قارن النسبة المئوية للخلايا السالبة لـ IgM في المجموعات الضابطة مقابل الخلايا التي تم فيها تثبيط S-H-R-N-A. تم ترانسفكشن ناقل تعبير زائد ريتروفيروسي لـ ID في خلايا bosque 23.تم بعد ذلك حصاد الفيروسات واستخدامها لإصابة خلايا Ramos، سواء النوع البري (wt) أو الخلايا التي تفرط في التعبير عن AID (a ID.High). تم استزراع الخلايا بشكل فردي وتربيتها لمدة ثلاثة أسابيع، وعند هذه النقطة تم تحليل التعبير الجيني باستخدام qPCR. وكما هو متوقع، أظهرت نتائج qPCR زيادة ملحوظة في تعبير AID بعد إصابة الخلايا بناقل الإفراط في التعبير عن AID. كما تم تقييم فقدان IGM في الخلايا المصابة بواسطة تقنية FACS. تم قياس IGM السطحي بواسطة FACS من الشكل السابق عند النقطة الزمنية لثلاثة أسابيع، وحُسبت نسبة فقدان IGM للخلايا من النوع البري وخلايا AID high وتم تمثيلها بيانياً هنا؛ وكما هو متوقع، أظهرت الخلايا التي تفرط في التعبير عن AID فقداناً أكبر في IGM السطحي.في تجربة منفصلة، تم إنتاج فيروسات لينتيفيروسية في خلايا bosque 23 تحتوي إما على S-H-R-N-A غير ذي صلة كعينة ضابطة أو S-H-R-N-A ضد عامل إصلاح DNA عالي الدقة يُتوقع أن يوفر الحماية ضد SHM. بعد ذلك، تم إعداء هذه الفيروسات اللينتيفيروسية في مستنسخ عالي ID من خلايا Ramos. ومرة أخرى، تم تحليل التعبير الجيني، وكما كان متوقعاً، لوحظ انخفاض مستويات عامل إصلاح DNA في وجود S-H-R-N-A المستهدف ضد ذلك العامل. كما تم تحليل فقدان IGM في المستنسخات خلوية واحدة بعد ثلاثة أسابيع؛ وبما أنه يُعتقد أن عامل الإصلاح يوفر الحماية ضد الطفرات أثناء SHM، فإن غياب هذا العامل يؤدي إلى زيادة في فقدان IGM وSHM، كما يمكن ملاحظته في هذا الشكل.بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الإصابات الفيروسية باستخدام بنيات تحتوي على OVEREXPRESSION أو S-H-R-N-A في خط خلايا B الخام، ومن ثم كيفية قياس الطفرات المفرطة الجسدية في هذه الخلايا.

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن نقدم طريقة لاختبار المتغيرات BRCA1 في نسيج ثقافة تستند مقايسة لإصلاح تأشب مثلي الحمض النووي من التلف من خلال استنفاد الذاتية البروتين BRCA1 من خلية باستخدام رني واستبدالها متحولة نقطة BRCA1 الذي يحتوي على تغيير الترميز.

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

نحن هنا تصف في الجسم الحي الطفرات فحص لأعداد صغيرة من الخلايا المكونة للدم تنقيته باستخدام اسي نموذج الفأر وراثيا. الجين اسي يمكن عزل لتحديد التردد، والموقع، ونوع من المسوخ الحمض النووي نشأت عفويا أو بعد التعرض لgenotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

عوامل جينية يمكن أن تتفاعل مع البرامج الوراثية لتعدل التعبير الجيني وتنظيم وظيفة الخلية ب. من خلال الجمع بين التحفيز في المختبر ب-الخلايا وقرة-بكر، والفائق microRNA-تسلسل ونهجا مرناً-تسلسل، يمكننا تحليل جينية تحوير التعبير ميرنا والجينات في الخلايا باء.

على نطاق الجينوم التحوير بوساطة "تحليل المانع هداك" ميكرورناس ومرناس في "ب الخلايا التي يسببها" للخضوع تبديل فئة جزئ الحمض النووي وتمايز خلية البلازما

كشف تعميم الحمض النووي الريبي (كرنا) من الدم حاجة غير ملباة في التشخيص السريري. هنا يمكننا وصف الأساليب التي تميز كرنا من مرضى سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة استخدام حساسة ومحددة الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل. الاختبارات تلبية متطلبات التصميم للكشف عن المتغيرات الانصهار في غضون 72 ساعة.

الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

هنا، يمكننا وصف في الموقع تهجين الإنزيم الذي تمكن من كشف حساسة ومحددة لمتواليات قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 مع قرار واحد-النوكليوتيدات على مستوى خلية واحدة. المقايسة، التي يمكن أن يؤديها يدوياً أو تلقائياً، يمكنك تمكين التصور المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة، والطفرات في سياق النسيج.

تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة

نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتحديد الأحداث جزئ المتجانسة التي وقعت في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبية و/أو PCR. ويتجلى هذا الأسلوب توليد نونموسكلي الميوسين الثانية استبدال الوراثية الماوس النماذج باستخدام الجنينية يستند إلى الخلية الجذعية المتجانسة اقترانها بوساطة تستهدف التكنولوجيا التقليدية.

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

هذه المخطوطة وصف أسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) للتحقيق بسيطة وسريعة لدور متعددة الجينات المرشحة في سرطان الدم النقوي الحاد (AML) انتشار الخلايا في موازية. هذه التقنية قابلة للتطوير ويمكن تطبيقها في خطوط خلايا السرطان الأخرى كذلك.

تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

هنا هو المقايسة لتحديد التبدل الجسدي داخل الغلوبولين المناعي الثقيلة سلسلة جراد الجينات باستخدام الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير الماوس.

تحليل Hypermutation الجسدية في intron JH4 من الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير ماوس

تقدم هذه المقالة تطبيق طريقة الكشف منخفضة التردد على أساس تسلسل سانجر في سرطان الغدد الليمفاوية الوعائية. توفير أساس لتطبيق هذه الطريقة على الأمراض الأخرى.

تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر للكشف عن الطفرة الجسدية منخفضة التردد

يصف هذا البروتوكول نهج فحص CRISPR القابل للتوسع داخل القنوات، مما يتيح دراسات موازية لإزالة وتنشيط الجينات في الجسم الحي في غدة الثدي الفأرية.

الفحص المتوازي في الجسم الحي لإزالة الجينات وتفعيله في غدة ثديي الفأر

اكتشف طريقة تغيير التعبير الجيني في خلايا B راموس باستخدام العدوى الفيروسية لقياس تأثيره على الطفرة الجسدية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد عوامل جديدة متورطة في تنوع الأجسام المضادة.

تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة

استكشف المزيد من الفيديوهات