تقييم Hypermutation الجسدية في خلايا B راموس بعد Overexpression أو ضربة قاضية لجينات معينة

الهدف العام من التجربة التالية هو تغيير التعبير عن جين معين ومن ثم قياس تأثير ذلك على الطفرات المفرطة الجسدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترانسفكشن خلايا Bosque 23 لإنتاج جسيمات فيروسية تحتوي إما على بنية مفرطة التعبير أو بنية تحتوي على SHRA. وكخطوة ثانية، يتم إيضفاء العدوى على خلايا ramo باستخدام هذه الفيروسات، مما يؤدي إما إلى تثبيط أو زيادة التعبير عن الجين المستهدف.

بعد ذلك، يتم إنماء مستعمرات الخلايا الفردية لعدة أسابيع للسماح للخلايا بتراكم الطفرات. وفي النهاية، يمكن تحديد تأثير التعبير الجيني المتغير بناءً على تحليل فقدان IgM ومن خلال تسلسل جينات IG. قد تساعد هذه الطريقة في تحديد عوامل جديدة تشارك في تنويع الأجسام المضادة.

ابدأ بصب 600 µL من وسط DMEM الدافئ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. ثم مع الحرص على الماصة مباشرة في الوسط، أضف 30 µL من FU gene six إلى الأنبوب، وقم برج المحلول باستخدام جهاز الفورتكس لأقل من ثانية واحدة، ثم حضّن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، بالنسبة للعدوى الفيروسية البطيئة مثل هذه الحالة، أضف 6 µg من بنية S-H-R-N-A و 1.5 µg من كل من P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E و PRSV rev إلى خليط DMEM و FU gene six.

قم برج المحلول باستخدام جهاز الدوامة (Vortex) لفترة وجيزة، ثم حضن الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة مرة أخرى، وهذه المرة لمدة 25 دقيقة. وأخيراً، قم بنقل جين D-N-A-D-M-E-M FU إلى مستنبت خلايا Bosque 23 بكثافة تتراوح بين 50 و 60%. اخلط الخلايا ثم حضنها عند درجة حرارة 37 °C ونسبة 5% CO2 لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي، أضف 5 mL من DMEM إلى الخلايا وأعدها إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. وفي اليوم الثالث بعد عملية عفن الخلايا (transfection)، استخدم محقنة سعة 10 mL لجمع 10 mL من الوسط من الخلايا المنقولة 23، ثم قم بتثبيت مرشح بمقاس 0.45 µm في طرف المحقنة. اجمع الوسط المرشح في أنبوب بولي بروبيلين نظيف سعة 15 mL. قبل 24 ساعة من العدوى، قم بزراعة 2 mL من خلايا ramo بتركيز 2 × 10⁵ خلايا/mL في وسط RPMI كامل في طبق سداسي الفجوات. وفي اليوم التالي، أضف 3 µL من محلول poly brain بتركيز 10 µg/mL، و 1 mL من الفيروس إلى خلايا ramo، ثم اخلط معلق الخلايا جيداً باستخدام الماصة.

بالنسبة لعينة الضبط غير المصابة، أضف 1 mL من وسط RPMI الكامل و 3 µL من poly brain إلى إحدى الفتحات بدلاً من الفيروس. كما يجب إصابة فتحة أخرى بضابط سلبي مطابق، وفتحة أخرى بـ vector يحتوي على GFP لتحديد كفاءة الإصابة عبر تقنية fax. الآن، قم بطرد مركزي للصفيحة ذات الست فتحات بسرعة 3000 ×g لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد الصفيحة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة.

أخيرًا، قم بطرد الخلايا المصابة مركزياً في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 milliliter بسرعة 400 Gs لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اشفط الوسط مع التأكد من عدم تعريض طبقة الخلايا للاضطراب، وأعد تعليق الخلايا في وسط RPMI جديد. بعد عدّ الخلايا، قم بتخفيف كمية من خلايا ramo المصابة لتصل إلى 10 cells per milliliter.

في محلول من وسط RPMI المكيّف وFBS ليصل الحجم النهائي إلى 10 ملليلتر لكل طبق مستزرع. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لاستزراع أطباق ذات 96 بئراً بوضع 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة في كل بئر.

بعد تحضين الأطباق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون، استخدم المجهر لفحص كل بئر على حدة. وذلك للتأكد من وجود الخلايا، حيث يمكن أن يكون تحديد العمق المناسب لتمييز الخلايا المفردة أمراً صعباً. في البداية، حاول التركيز على أرقام الآبار المطبوعة في قاع طبق الـ 96 بئراً.

ثم حاول البحث عن الخلايا بعد مرور أسبوعين. افحص وجود مستعمرات خلوية على طول حواف الآبار باستخدام حبر دائم. حدد الآبار التي تظهر نمواً خلوياً قوياً، ثم انقل المستعمرات إلى أطباق ذات 24 بئراً في 1 mL من وسط RPMI لمزيد من الحضن.

بعد عدة أيام من النمو، انقل الخلايا إلى طبق ذي ستة آبار واستمر في تحضين المزارع. بعد ثلاثة أسابيع من استزراع المستعمرات الخلوية في الطبق ذي الستة آبار، انقل 5 × 10⁵ من الخلايا من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. وفي هذا الوقت، قم أيضاً بحصاد الخلايا من كل بئر من آبار التحكم وآبار تثبيط HRNA، بالإضافة إلى عينة واحدة لتكون بمثابة تحكم غير مصبوغ.

الآن قم بطرد جميع الخلايا مركزياً عند 400 Gs لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع غسل الخلايا مرتين باستخدام 1 ml من PBS في عملية الطرد المركزية الثانية. بعد الغسلة الثانية، نقوم بتعليق ركازة مجموعة الضبط غير المصبوغة في 50 µL من PBS، وتعليق الركازات الأخرى في PBS مضافاً إليه تخفيف بنسبة 1:20 من الأجسام المضادة anti-human IGM الموسومة بـ PE. بعد ذلك، يتم تحضين جميع عينات الخلايا على الثلج لمدة ساعة واحدة، ثم تُغسل الخلايا مرتين إضافيتين باستخدام PBS كما سبق، ويُتخلص من الرائق ويُعاد تعليق جميع الركازات في 100 µL من PBS.

بعد ذلك، انقل الخلايا المصبوغة والخلية الضابطة غير المصبوغة بعد إعادة تعليقها إلى أنابيب fax، ثم قم بتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي. قارن النسبة المئوية للخلايا السالبة لـ IgM في المجموعات الضابطة مقابل الخلايا التي تم فيها تثبيط S-H-R-N-A. تم ترانسفكشن ناقل تعبير زائد ريتروفيروسي لـ ID في خلايا bosque 23.

تم بعد ذلك حصاد الفيروسات واستخدامها لإصابة خلايا Ramos، سواء النوع البري (wt) أو الخلايا التي تفرط في التعبير عن AID (a ID.High). تم استزراع الخلايا بشكل فردي وتربيتها لمدة ثلاثة أسابيع، وعند هذه النقطة تم تحليل التعبير الجيني باستخدام qPCR. وكما هو متوقع، أظهرت نتائج qPCR زيادة ملحوظة في تعبير AID بعد إصابة الخلايا بناقل الإفراط في التعبير عن AID. كما تم تقييم فقدان IGM في الخلايا المصابة بواسطة تقنية FACS. تم قياس IGM السطحي بواسطة FACS من الشكل السابق عند النقطة الزمنية لثلاثة أسابيع، وحُسبت نسبة فقدان IGM للخلايا من النوع البري وخلايا AID high وتم تمثيلها بيانياً هنا؛ وكما هو متوقع، أظهرت الخلايا التي تفرط في التعبير عن AID فقداناً أكبر في IGM السطحي.

في تجربة منفصلة، تم إنتاج فيروسات لينتيفيروسية في خلايا bosque 23 تحتوي إما على S-H-R-N-A غير ذي صلة كعينة ضابطة أو S-H-R-N-A ضد عامل إصلاح DNA عالي الدقة يُتوقع أن يوفر الحماية ضد SHM. بعد ذلك، تم إعداء هذه الفيروسات اللينتيفيروسية في مستنسخ عالي ID من خلايا Ramos. ومرة أخرى، تم تحليل التعبير الجيني، وكما كان متوقعاً، لوحظ انخفاض مستويات عامل إصلاح DNA في وجود S-H-R-N-A المستهدف ضد ذلك العامل. كما تم تحليل فقدان IGM في المستنسخات خلوية واحدة بعد ثلاثة أسابيع؛ وبما أنه يُعتقد أن عامل الإصلاح يوفر الحماية ضد الطفرات أثناء SHM، فإن غياب هذا العامل يؤدي إلى زيادة في فقدان IGM وSHM، كما يمكن ملاحظته في هذا الشكل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الإصابات الفيروسية باستخدام بنيات تحتوي على OVEREXPRESSION أو S-H-R-N-A في خط خلايا B الخام، ومن ثم كيفية قياس الطفرات المفرطة الجسدية في هذه الخلايا.