استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات
فبراير 22, 2012
نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لسحق العصب الوركي الماوس. هذا الأسلوب يستخدم الملقط مرقئ متاحة بسهولة ويسر، وبتكاثر تنتج كاملة سحق العصب الوركي. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة لإعداد يتصاعد العضلات كلها مناسبة للتحليل من تجديد العصب بعد سحق العصب الوركي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة بسيطة قابلة للتكرار لسحق العصب الوركي وتحليل التثبيت الكامل لإعادة تعصيب العضلات بعد سحق العصب الوركي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض العصب الوركي أولا ، بما في ذلك الترتيب المناسب للضاغطات الجراحية لضمان الوصول الجيد إلى العصب. بعد ذلك ، سحق العصب باستخدام ملقط الإرقاء وقم بتمييز العصب بالفحم.
ثم قم بإزالة العضلات الفردية التي عصبها العصب الوركي من الطرف الخلفي. الخطوة الأخيرة هي تشريح العضلات الفردية لتحليل الجبل بالكامل بعد تلطيخ المناعة. في النهاية ، توضح النتائج أنه يمكن إجراء سحق العصب الوركي القابل للتكرار ببساطة ويمكن استخدام حوامل ثقب العضلات لتحليل التجديد اللاحق.
الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه يوفر تقنية بسيطة قابلة للتكرار لسحق العصب الوركي وبالتالي تسجيل التجديد المحوري. ابدأ هذا الإجراء بتخدير الفأر للجراحة باستخدام مزيج من 100 ملليغرام لكل كيلوغرام من الكيتامين و 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق لتقليل ألم ما بعد الجراحة. يتلقى الفأر أيضا حقنة تحت الجلد بمقدار 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من ميلوكسيكام.
بعد ذلك ، احلق كلا الخلفين بعناية باستخدام مقص جراحي. ثم ضعي كريم إزالة الشعر للاستنفاد الكامل. نظف البشرة باستخدام قضيب قطني معقم ومقشر جراحي من البيتادين.
بعد ذلك ، ضعي مرهم العيون على العينين باستخدام قضيب قطني معقم. ضع الماوس على صفيحة نظيفة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق بطانية مسخنة مسبقا ، وحافظ على درجة حرارة عند 37 درجة مئوية. ثم قم بلصق جميع الأطراف لأسفل.
ضع الطرف الخلفي بعناية بشكل متماثل بحيث يصنع مفصل الركبة زاوية قائمة مع الجسم. بعد ذلك ، قم بتغطية المجال الجراحي بسترى معقمة تحت المجهر. قم بعمل شق نصف دائري عبر خط الوسط.
افصل الجلد برفق عن العضلات الأساسية وقم بطيه من وقت لآخر. ضع حوالي 0.1 مل من محلول ملحي معقم للحفاظ على رطوبة موقع الجراحة أثناء العملية. بعد ذلك ، افتح المستوى اللفافي بين الألوية الكبيرة والرأس الأمامي للعضلة ذات الرأسين الفخذية.
للكشف عن العصب الوركي للتحكم الجراحي. يجب تعريض العصب الوركي المقابل وتعبئته ، ولكن يجب تركه سليما. ثم استراحة وخياطة عضلات الألوية.
كشف العصب الوركي التجريبي بنفس الطريقة مع الضاعات. لتسهيل التصور. حرر العصب الوركي برفق من النسيج الضام المحيط باستخدام مقص استئصال القزحية.
ثم استخدم ملقط 5 45 دقيقة لوضع العصب في الفك السفلي للملقط المرقئ فائق النعومة ، محاذاة اللفافة الثلاثة بجوار وليس فوق بعضها البعض. تم نقش ملقط مرقئ بعلامة على بعد 1.5 ملم من طرفها. ضع الجزء الخارجي من الوركي بما يتماشى مع هذه العلامة قبل سحقها.
هذا يضمن سحق العرض المنتظم وأن العصب لا يمتد إلى ما وراء فكي ملقط المرقئ عند تسويته بسبب قوة التكسير. إذا امتد العصب إلى ما وراء أطراف الملقط ، سحق العصب جزئيا فقط. استخدم زوجا ثانيا من الملقط المرقئ الذي تم غمسه مسبقا ومسحوق الكربون لتحديد موقع السحق.
سحق العصب في نفس موقع السحق لمدة 15 ثانية بثلاث نقرات. يجب ألا تمتد أي علامة كربونية إلى ما وراء حدود السحق الأولي. هذا مهم بشكل خاص إذا كانت هناك حاجة إلى وضع علامات دقيقة على موقع السحق لغمس الملقط مسبقا في الكربون ومنع انتشار الكربون في موقع الجراحة.
افتح الملقط في مسحوق الكربون. ثم أغلقها برفق. استخدم شاشا معقما لمسح الكربون الموجود على السطح الخارجي للمرقئ.
افحص الملقط تحت تكبير ثلاثة أضعاف على الأقل للتحقق من أن أسطح التكسير مغلفة بالتساوي بمسحوق الكربون. إذا لزم الأمر ، يتم إعادة غمسها ومسحها وخياطة عضلات الألوية بنفس طريقة الجانب المقابل. أخيرا ، أغلق شق الجلد باستخدام مقاطع انعكاسية تسعة ملليمترات.
إذا تم العثور على مقاطع انعكاسية تسعة ملليمترات لتقييد الحركة ، فيمكن استخدام مقاطع انعكاسية أصغر أو ست خيوط جراحية. بدلا من ذلك ، بعد التضحية بالماوس ، قم بإزالة أربع عضلات. الظنبوب الباسطة الأمامية الباسطة اللونجة الطويلة ، الشظوية الطويلة ، والنعل في الطرف الخلفي بعناية عن طريق التثبيت من خلال الأنسجة الضامة على طبق مغطى باللون الأسود.
ثم اشطفها في PBS. بعد ذلك ، قم بإصلاحها في 4٪ ألدهيد Paraform لمدة 30 دقيقة. لتشريح كل عضلة على طبق بتري مغطى باللون الأسود ، قم بإزالة الأوتار منها باستخدام مقص استئصال القزحية.
بعد ذلك ، قم بترقيق العضلات عن طريق تقشير ألياف العضلات الداخلية حافظ بعناية على السطح الخارجي للعضلة ، بما في ذلك العصابات الطرفية. ثم قم بتركيب العضلات الناتجة على شرائح إضافية مع درع متجه وزلات غطاء زجاجي مقاس 22 × 40 ملم تغلق الجانبين بطلاء أظافر شفاف. عندما يتم تركيبها بشكل صحيح على الشريحة ، يجب أن تكون أشرطة nplate على اتصال مع زلات الغطاء.
فيما يلي مثال على موقع سحق في الموقع في الطرف الخلفي الأيسر. يشار إلى موقع السحق بالكربون الأسود. تشير العلامة النجمية إلى فرع من العصب الظنبوبي الذي يعصف عضلات الفخذ ويعمل كمعلم مفيد.
أثناء جراحة السحق ، يتم تحديد الانقسام الظنبوبي للعصب الوركي باللون الأزرق والشظوي والأخضر والرقي والأصفر. يوضح هذا القسم شبه الرقيق سحقا كاملا يتم إجراؤه باستخدام ملقط مرقئ. تشير رؤوس الأسهم إلى الألياف المكسرة هنا.
يشار إلى السحق غير المكتمل الذي يتم إجراؤه باستخدام الملقط الزاوي في قسم آخر من شبه الزعنفة. يشير رأس السهم مرة أخرى إلى الألياف المكسرة بينما تشير الأسهم إلى المحاور المحفوظة. هذه هي الصور المعروضة من عضلات الجبل بأكملها.
بعد إزالة النسيج الضام والتخفيف اللاحق ، يتم تحديد العصابات nplate على كل عضلة. يظهر هنا عضلة الجبل الكاملة. بعد 14 يوما من سحق العصب الوركي.
تشير الأسهم إلى مناطق الوصلة العصبية العضلية التي أعيد تعصيبها بواسطة محور عصبي. هنا هو العرض التوضيحي للتقاطع العصبي العضلي منزوع العصاب. يشار إلى الفجوة 43 عملية خلية شوان الإيجابية بواسطة رؤوس الأسهم.
لا تظهر محاور عصبية في هذا التقاطع العصبي العضلي منزوع العصاب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية سحق العصب الثابت بشكل متكرر وإعداد حوامل هرمون العضلات لتحليل التجديد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يصف هذا التقرير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لسحق العصب الوركي للفأر وتحليل إعادة التعصيب العضلي. تستخدم التقنية أدوات تثبيت نزيف متاحة بسهولة لتحقيق سحق كامل للعصب وتشمل تحضير تركيبات عضلية كاملة لتحليل التجدد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الطب التجديدي
- فيزيولوجيا العضلات
الخلفية
- يمكن أن تؤدي إصابات العصب الوركي إلى عجز حركي كبير.
- فهم التجدد العصبي أمر حاسم لتطوير استراتيجيات علاجية.
- يوفر تحليل التركيب الكامل رؤى حول إعادة تعصيب العضلات.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى إمكانية التكرار وإمكانية الوصول.
هدف الدراسة
- لإظهار طريقة قابلة للتكرار لسحق العصب الوركي.
- لتحضير التركيبات العضلية الكاملة لتحليل التجدد العصبي اللاحق.
- لتوفير بروتوكول مباشر يمكن تبنيه بسهولة من قبل الباحثين.
الطرق المستخدمة
- فضح العصب الوركي باستخدام أدوات جراحية للسحب.
- سحق العصب باستخدام أدوات تثبيت نزيف وتمييزه بالفحم.
- إزالة العضلات الفردية المغذية بواسطة العصب الوركي من الطرف الخلفي.
- تشريح العضلات لتحليل التركيب الكامل بعد التلطيخ المناعي.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة بسحق العصب الوركي بشكل متسق وكامل.
- يمكن تحليل التركيبات العضلية الكاملة بشكل فعال للتجدد.
- تظهر النتائج جدوى هذا النهج لدراسة إصلاح العصب.
- تساهم النتائج في فهم عمليات إعادة تعصيب العضلات.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أداة موثوقة للباحثين الذين يدرسون إصابات العصب.
- يعتبر تحليل التركيب الكامل تقنية قيمة لتقييم إعادة تعصيب العضلات.
- يمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة في إعدادات بحثية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method provides a reproducible model for studying peripheral nerve regeneration, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical neuroscience programs. By standardizing sciatic nerve crush and quantifying reinnervation via whole mount muscle analysis, it supports target validation and assay development for neuroprotective or neuroregenerative candidates. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking axonal growth to functional reinnervation readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on axonal regeneration and Schwann cell interactions in a genetically tractable model.
- Operational Value: Uses widely available transgenic mouse lines to dissect molecular mechanisms of nerve repair with high reproducibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-ready outputs (e.g., neuromuscular junction reinnervation) for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardizes crush site marking and muscle preparation to ensure assay consistency across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by modeling axonotmesis, a clinically relevant peripheral nerve injury.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through longitudinal, structure-function correlation of regeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a disease-relevant system for evaluating biologics or small molecules aimed at enhancing nerve repair.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by enabling precise measurement of axonal regeneration kinetics.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable dependent variables (e.g., reinnervated endplate bands) for compound effect assessment.
- Analytics: Generates statistical outputs from whole mount imaging that allow comparison of regeneration efficacy across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using a rodent model predictive of human peripheral nerve lesion responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated use in target de-risking and lead optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of axonal-Schwann cell-basal lamina interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized crush force, site marking, and muscle whole mount protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, histology-based regeneration metrics early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on functional reinnervation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, tissue dissection, and immunofluorescence staining.
- Depends on access to stereomicroscopes, hemostatic forceps, and imaging systems for whole mount analysis.
- Necessitates cross-team standardization of crush duration, marking technique, and muscle fixation timing.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the need for terminal procedures and skilled handling to maintain crush consistency and marking fidelity.
