Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

تم تحسين هذا البروتوكول لتغليف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات وتمايزها إلى خلايا عصبية دوبامين في نظام ثلاثي الأبعاد. أولا ، عالج المستعمرات بمثبط الصخور أو RI وربطها بخلايا مفردة مع حاد ممزوج بألجينات الصوديوم وتمر عبر جهاز التغليف. استمر في علاج RI لمدة ثلاثة أيام ، وانقل الخلايا المغلفة إلى ست خلايا PA وتمايز لمدة 28 يوما.

في النهاية ، يظهر تحليل التعبير الجيني والبروتيني كفاءة أعلى في توليد الخلايا العصبية الدوبامينية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية الخاصة على بروتوكول التمايز ثنائي الأبعاد الحالي هي أننا نحاول نشر هذه الخلايا وتمييزها في بيئة ثلاثية الأبعاد وتوفر لك البيئة ثلاثية الأبعاد فرصة لنشر الخلايا بطريقة عالية الكثافة. ومن ثم يعطي أيضا فرصة للحصول على تفاعل أفضل بين الخلية والخلية للتمايز.

وثالثا ، يمنحك أيضا كفاءة أفضل للتمايز على المسار. وأيضا ، إذا كان بإمكاني أن أضيف نوعا ما أن هذه التقنية المعينة يمكن أيضا تكييفها مع نوع آخر من الخلايا ، والتي يمكننا نشرها في بيئة ثلاثية الأبعاد. تذكر الآن أيضا مثل على سبيل المثال ، تم تحسين هذه التقنية بالذات بناء على استخدام مثبط صخور معين يمنع موت الخلايا المبرمج للخلايا ويمنع أيضا انفصال الخلية عن أطباق الاستزراع.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في البداية لأن هذه التقنية لا يتم إجراؤها عادة في زراعة الأنسجة. تم تحسين تقنية التغليف التالية بناء على الدراسات الموجزة للدكتور دين الدكتور تشاد حول تطبيق نوع مثبط R من الألجينات وتركيز الجينات وإعدادات جهاز التغليف. سيوضح جيمي وكيم ، طالب دكتوراه من مختبرنا ، هذا البروتوكول الآن.

أضف 25 مل من محلول الجيلاتين المعقم 0.1٪ إلى 275 ملليغرام من ألجينات الصوديوم المنقى في دوامة أنبوبية معقمة سعة 50 مليلتر لإذابة مسحوق الجينات جزئيا. ثم ضع الأنبوب على خلاط مداري بمعدل 10 أضعاف G بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، أضف 9٪ كلوريد الصوديوم المعقم إلى محلول الجينات.

دوامة لمدة 30 ثانية ثم جهاز طرد مركزي عند 95 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بتخزين محلول الجينات عند أربع درجات مئوية. أولا في بيئة مظلمة ، قم بمعالجة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مسبقا بوسائط مزرعة مكملة ب 10 ميكرومولار من مثبطات الصخور.

احتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. الآن اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS لإخراج الخلايا إنزيميا. يضاف الأكوتان ويحتضن لمدة 10 دقائق.

عند 37 درجة مئوية ، قم بحصاد الخلايا برفق باستخدام مكشطة خلية ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بتحييد Accutane بحجم متساو من وسط SL. ثم مرر الخلايا المعادلة عبر مرشح 40 ميكرون إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.

استخدم الآن مقياس الخلوي الدموي لتعداد الخلايا. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وتجاهل بعناية supinate. ثم اغسل الخلايا مرة واحدة بالتدفئة.

0.9٪ كلوريد الصوديوم. الطرد المركزي مكاسبك وتخلص من supinate. لتغليف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، ابدأ بتعليق الخلايا بمحلول الجينات الدافئ

للقيام بذلك ، قم بتوصيل حقنة سعة 20 مليلتر بأنابيب بلاستيكية ناعمة وشفط الجينات في المحقنة. ثم امزج معلق الخلية برفق باستخدام المحقنة دون تكوين فقاعات. الآن استنشق الخلايا في المحقنة.

تخلص من الأنبوب البلاستيكي ثم قم بتوصيل المحقنة بآلة التغليف. انتقل إلى الأدوات التي تم إعدادها لمولد الخرزة ، ومضخة الحقنة ، ومقياس تدفق الهواء ، وحمام هطول الأمطار بكلوريد الكالسيوم. تحقق من وجود فجوة 10 سنتيمترات بين نهاية آلة التغليف ونقطة تجميع أطباق بتري.

بعد ذلك ، اضبط مضخة الحقنة على 10 ملليلتر في الساعة. معدل تدفق الهواء بمعدل ثمانية لترات في الدقيقة وضغط 100 كيلو باسكال. اجمع الخلايا المغلفة في حمام هطول الأمطار الدافئ لمدة سبع دقائق.

ثم انقلها عن طريق الشفط اللطيف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر يحتوي على 20 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم ، واسمح للكبسولات بالاستقرار في قاع الأنبوب ، والتخلص من السوبينات برفق ، ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 0.9٪ كلوريد الصوديوم. استمر في إعادة تعليق الخلايا المغلفة في وسط زراعة التسخين المسبق ، مع استكمال مثبط الصخور. انقله إلى قارورة استزراع واحتضانه لمدة ثلاثة أيام.

زرع خط لحمة الفأر PA ست خلايا في قارورة T 75 المغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ وتكييف وسط التمايز العصبي الدوبامين لمدة 24 ساعة. انقل الكبسولات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر واتركها تستقر في قاع الأنبوب. تجاهل supinate وإعادة تعليق الكبسولات في السلطة الفلسطينية ستة خلايا حالة التمايز العصبي الدوبامين.

ثقافة متوسطة. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة مع طبقة أحادية الطبقة المكونة من ستة خلايا PA لمدة 21 يوما. عند تجديد تغيير الوسائط.

يستمر نصف وسائل الإعلام فقط في كل مرة في زراعة الخلايا الست PA في التمايز العصبي الدوباميني. متوسط مكمل بعوامل محفزة لمدة أسبوع واحد. قم أولا بشفط الكبسولات ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا.

عندما تستقر الكبسولات في القاع ، تخلص من الاستياء. يغسل مرتين باستخدام DPBS ، وتخلص من supinate. ثم أضف خمسة ملليلتر من محلول decap ululating واخلط المعلق جيدا.

احتضن لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي للحبيبات ، تشرع خلايا التفريغ والغسيل مرتين باستخدام DPBS في استخدام خلايا decap إما كثقافة أحادية الطبقة أو للتحليل الفوري للمصب في التحضير النموذجي ، يتراوح قطر أغطية الألجينات الدقيقة بين 400 و 500 ميكرون.

هنا ، اختبار C-F-D-A-P-I. تحدد النتائج الخلايا المغلفة الخضراء القابلة للحياة بنسبة 80٪ من تحليلات قابلية البقاء والانتشار وموت الخلايا المبرمج للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة في نقاط زمنية مختلفة تعمل على تحسين ظروف الاستزراع. ومن المثير للاهتمام ، أن تأثيرات مثبطات الصخور تمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن التفكك وتحافظ على بقاء الخلية مع إشارة إلى النمو المتفوق للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة المزروعة في H-F-F-C-M plus ri.

يطبق هذا المثال تغليف الخلايا كمنصة ثلاثية الأبعاد للتمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المغلفة إلى خلايا عصبية الدوبامينية. كما هو متوقع ، يزداد حجم أجسام الجنين بمرور الوقت على الخلايا الكبسولة ، وتظهر الخلايا مورفولوجيا الخلايا العصبية التقدمية بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الثقافة مع أكثر من 90٪ من الجدوى. يشير تحليل التعبير الجيني إلى تقليل تنظيم العلامة متعددة القدرات OCT أربعة.

الأهم من ذلك ، أن علامة السلف العصبي PAC ستة وعلامة الخلايا العصبية الدوبامينية لا تزال منظمة بعد سبعة أيام من التمايز. تشير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة إلى أكبر من 90٪ من الخلايا العصبية الإيجابية بعد 21 يوما. يؤكد تحليل الخسارة الغربية أنماط التعبير المواتية ل TH و PAC ستة تحت أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مقابل 2D.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية بشكل فعال في غضون ساعتين. تذكر أن تعالج الخلايا بمثبطات الصخور قبل التغليف وبعده. يمكن للمحفزات أو المثبطات المتغيرة تخصيص بروتوكول التمايز ثلاثي الأبعاد للتجارب المستقبلية.

هذه التقنية الخاصة لتغليف ESL البشري والتمييز بينها في بيئة ثلاثية الأبعاد أو لإمكانية العلاج الخلوي لعدد من الأمراض ، وخاصة مرض باركنسون.