إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في استخدام طريقة فعالة للحصول على معلومات متزامنة من أنسجة متعددة حول التعبير البروتيني في مشروع عالي الإنتاجية مثل أطلس البروتينات البشرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق اختيار مناطق ممثلة من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين، ثم يتم تثقيب المناطق المحددة وتجميع العينات المختارة في قالب بارافيني واحد، وهو ما يعرف بالمصفوفة النسيجية المجهرية.

بعد ذلك، يتم قطع مقاطع من مصفوفة الأنسجة المجهرية (TMA) وإجراء صبغ كيميائي نسيجي مناعي. وأخيراً، يتم تحليل نمط التعبير البروتيني ونشر البيانات في أطلس البروتينات البشرية. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح التعبير البروتيني في الأنسجة والخلايا من خلال مصفوفات الأنسجة المجهرية والصبغ الكيميائي النسيجي المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل إجراء الكيمياء النسيجية المناعية من كتل نسيجية مفردة، في إمكانية الحفاظ على المواد البيولوجية القيمة وزيادة إمكانية تكرار التجارب. ومن المزايا الأخرى لهذه التقنية هي القدرة على خفض تكاليف ENT وكذلك تقليل وقت المعالجة المختبرية. سيقوم إيان كول باي، وهو فني مختبر من مختبري، بشرح هذا الإجراء للحصول على طول موحد للعينات النسيجية الأسطوانية.

قم بتحديد موضع المِسبار. يُوصى بترك هوامش تتراوح بين 2.5 إلى 3.0 مليمتر على كل جانب من قالب البارافين لتجنب تشقق البارافين عند تركيب القاطعات المناسبة. قم بفك براغي المقبس السداسية التي تثبت القاطعة في مكانها، ثم ضع القاطعة بحيث يكون المجرى الموجود في محور القاطعة موضوعاً بإحكام مقابل القضيب المعدني في الكتلة البلاستيكية على شكل V.

أحكم ربط البراغي، مع التأكد من أن حافة المشبك المعدني في وضع أفقي. أدخل خرامة المستقبل على اليسار وخرامة المانح على اليمين. استخدم مقابض ضبط XY وقراءات الميكرومتر الرقمية الخاصة بها لتحريك الخرامات على طول المحورين X و Y.

لإعادة ضبط الجهاز، اضغط على زر الصفر (zero a BS) للتبديل بين البوصة والمليمتر، ثم اضغط على زر البوصة/مليمتر (inch millimeter). عند استخدام خرامة بمقاس 1 mm لقالب مقاس 9×8، يجب أن تكون المسافة بين الثقوب 2 mm كما تُقاس بين مراكز الثقوب لمنع دفع خرامة الاستقبال إلى الأسفل بشكل مفرط وإتلافها؛ لذا، قم بتحديد العمق الأقصى لدفع الخرامة عن طريق وضع كاسيت فارغ في الحامل واستخدام برغي إيقاف العمق الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من دليل Z، ثم اضبط الموضع السفلي لخرامة الاستقبال ليكون أعلى بـ 1 mm من قاع الكاسيت. بعد اختيار وتحديد المنطقة ذات الصلة في مقطع نسيجي وتصميم قالب لإنتاج مصفوفة الأنسجة الميكروية (tissue microarray)، ضع كتلة الاستقبال في الحامل واستخدم أصغر مفك براغي لتثبيت البراغي.

تجنب الإفراط في ربط البراغي لمنع انفصال البارافين عن الكاسيت. ادفع خرامة المستقبل لأسفل بمقدار خمسة مليمترات تقريبًا داخل كتلة المستقبل، واستخدم المقبض الموجود في الخرامة لتدويرها ذهابًا وإيابًا. بعد ذلك، خفف ضغط الدفع لأسفل ببطء حتى تتمكن النوابض من تحريك الخرامة للأعلى.

استخدم المنسق لتفريغ الخرامة والتخلص من لب البارافين. بعد ذلك، حرك البرج للتبديل إلى خرامة المانح. ثم ضع جسر كتلة المانح بحيث تكون كتلة المانح فوق حامل كتلة المستقبل.

استخدم شريحة صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين المقابلة التي تم تحديد المنطقة المستهدفة فيها لتحديد موقع النسيج المراد أخذ عينة منه. ثبت كتلة المانح يدويًا في موضعها باليد اليسرى وادفع أداة الثقب باليد اليمنى. لا تضغط على المسبار. وبما أن مصد العمق لا يوقف حركة الثقب في الموضع المناسب لكتلة المانح، فمن المهم التوقف عن الدفع عندما تصبح العلامة الثانية مرئية على المسبار.

أدر مقبض الخرامة مرة واحدة ببطء. خفف الضغط للأسفل مع الاستمرار في تثبيت كتلة المانح على جسر كتلة المانح. ثم قم بإزالة الجسر وكتلة المانح.

تأكد من محاذاة ثاقبة المانح مع الثقب الذي تم إجراؤه مسبقاً. اضبط موضع الثاقبة باستخدام براغي التثبيت. إذا لم تكن ثاقبة المانح والثقب الموجود في كتلة المستقبل متطابقين، فادفع الثاقبة لأسفل بحذر حتى يصل طرفها إلى أعلى الثقب في كتلة المستقبل.

أثناء الحفاظ على هذه الوضعية، استخدم المسبار لتفريغ عينة النسيج الأساسية في الفتحة. يجب أن يكون سطح العينة الأساسية بمحاذاة سطح الكتلة. قم بإعادة البرج إلى خرامة الاستقبال.

انتقل إلى الموضع التالي باستخدام مقابض ضبط XY وكرر العملية مرة أخرى عن طريق ثقب عينة من الكتلة المستقبلة حتى تكتمل المصفوفة. لإزالة الكتلة المستقبلة، قم بفك البراغي الموجودة في الحامل. ضع الكتلة ووجهها للأسفل على شريحة زجاجية موضوعة على حامل مناسب، ثم قم بتجفيف الكتلة عند 42 درجة Celsius لمدة 40 دقيقة.

أخرج الشريحة والقالب من الفرن، ثم قم بتسوية سطح القالب عن طريق تمرير الشريحة الزجاجية عليه برفق. ضع القالب مع الشريحة الزجاجية على لوحة تبريد لمدة 10 دقائق. ثم أزل الشريحة الزجاجية من القالب.

أصبحت الكتلة الآن جاهزة لعملية القطع. بعد القطع، يتم صبغ مصفوفة الأنسجة الدقيقة ورقمنتها باستخدام جسم مضاد للبروتين المستهدف. ابحث عن البروتين في أطلس البروتينات البشرية (Human Protein Atlas) عبر زيارة الموقع الإلكتروني www.proteinatlas.org.

أدخل معرف المجموعة (ensemble id) أو رقم الوصول في UniProt أو اسم HGNC للبروتين المراد دراسته، على سبيل المثال، insulin. انقر فوق البروتين المعني وقم بالتمرير لأسفل وصولاً إلى ملخص الأنسجة والأعضاء الطبيعية. يوضح العرض العام تعبير البروتين في البنكرياس.

انقر فوق علامة التبويب. المزيد من بيانات الأنسجة. سيظهر عرض الأنسجة الطبيعية مرتبًا حسب العضو.

انقر على البنكرياس لعرض نتائج الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) لثلاثة أجسام مضادة موجهة نحو البروتين نفسه. انقر فوق الصورة لعرض صورة عالية الدقة للبنكرياس. تُظهر هذه الصورة أمثلة على جودة المصفوفات النسيجية الدقيقة، حيث تظهر مصفوفة مستقيمة ومحاذية بشكل صحيح مع وجود مساحة كافية بين الصفوف والأعمدة وحافة البارافين. وهنا، تظهر بعض النوى قريبة جداً من الحافة، مما يؤدي على الأرجح إلى حدوث مشكلات أثناء عملية التقطيع.

لقد تم تجفيف هذه المصفوفة النسيجية الدقيقة بالحرارة لفترة طويلة جداً مما أدى إلى انكماشها لعدم وجود القالب الصحيح. وهنا، تظهر مقطعية مقصوصة بشكل صحيح بأعمدة مستقيمة ومتراصفة مصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين. قد تؤدي الشفرة التالفة أو المتسخة إلى حدوث تشققات كما هو موضح هنا، أو إلى ظهور مقاطع مضغوطة كهذه.

تُظهر خلايا المركز الإنتاشي في العقد اللمفاوية جسماً مضاداً معايرًا بشكل مثالي، مما يؤدي إلى صبغ سيتوبلازمي محدد دون وجود خلفية كما هو موضح هنا. ويظهر صبغ سلبي أو ضعيف عندما يكون تركيز الجسم المضاد الأولي منخفضاً جداً أو إذا كان البروتين المستهدف غير موجود في الأنسجة المصبوغة مناعياً. أما هذا المقطع النسيجي فهو مفرط الصبغ نتيجة التركيز العالي جداً للجسم المضاد الأولي.

يؤدي اللون الداكن إلى صعوبات في تحديد الموقع تحت الخلوي بسبب التداخل، والتفاعل المتقاطع، والنتائج الإيجابية الكاذبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج مصفوفة علامات نسيجية وكيفية استخدامها عند تحليل التعبير البروتيني عن طريق إجراء الكيمياء النسيجية المناعية. كما يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصفح أطلس البروتينات البشرية للبحث عن التعبير البروتيني في الأنسجة والخلايا البشرية.