أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية: خارج الحي رني Electroporation في اللحاء المخي الفئران الجنينية
مايو 18, 2012
لإجراء تقييم سريع وظيفة الجينات في تطور قشرة الدماغ، ونحن تصف الأساليب التي تنطوي على خارج الحي electroporation من البلازميدات المشترك معربا عن الحمض النووي الريبي المثبطة (رني) وGFP في قشرة الفئران الجنينية. هذا البروتوكول هو قابل لدراسة مختلف جوانب النمو العصبي مثل الخلايا العصبية، والهجرة الخلايا العصبية والخلايا العصبية بما في ذلك التشكل التغصنات وثمرة محور عصبي.
الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء تقييم سريع لوظيفة الجينات في نمو القشرة الدماغية باستخدام شرائح عضوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال البلازميدات ، coex ، التعبير عن الحمض النووي الريبي والمثبط وعلامة GFP في القشرة الدماغية المونس. يتم تطبيق رشقات نارية كهربائية قصيرة على الدماغ ، مما يسمح للحمض النووي البلازميد بنقل الخلايا السلفية العصبية.
بعد ذلك ، يتم تشريح الأدمغة وتضمينها وتقسيمها لإنتاج شرائح عضوية يمكن أن تخضع لتشكل الخلايا العصبية خارج الجسم الحي. يمكن البحث عن الشرائح العضوية عن مجموعات الخلايا العصبية القشرية ذات العيوب المهاجرة أو المورفولوجية من خلال المراقبة المباشرة للخلايا المسماة GFP. مرحبا ، مرحبا بكم في مختبري في جامعة براون في قسم البيولوجيا الجزيئية اليوم ، ستظهر الدكتورة ليزا وطالبان ، كات زر ومارك سيبا تقنية التثقيب الكهربائي خارج الجسم الحي وثقافة الشرائح العضوية ، وهي تقنية مفيدة للغاية لدراسات النمو العصبي.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في جوانب مختلفة من النمو العصبي ، بما في ذلك تكوين الخلايا العصبية وهجرة الخلايا العصبية وتكوين الخلايا العصبية. نظرا لأن هذا التحليل يتم إجراؤه في تقريب قريب من بيئة IBU ، فإنه يوفر بديلا منخفض التكلفة وسريعا لتوليد المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية للجينات غير المعروفة الوظيفة. أخيرا ، بالمقارنة مع تقنية التشغيل الكهربائي في الجسم الحي ، فإن نجاح تجارب العملية الكهربائية في الجسم الحي لا يعتمد على الجراحة الماهرة وتطوير المهارات ويمكن إجراؤها بوقت تدريب أقصر ومهارة.
بعد القتل الرحيم لأنثى فأرة حامل ، قم بتشريح الأجنة إلى بارد مثلج ، واستكمل HBSS ، واحتفظ بها في أكياس المشيمة الفردية. بعد ذلك في محلول HBSS البارد ، حرر جنينا من الكيس واقطع رأسه بعد الفقرة الأولى للحقن ، ضع الرأس على قطعة من الورق الشكلي فوق طبق بتري باستخدام حقنة هاميلتون المصنوعة خصيصا. حقن ستة إلى ثمانية ميكرولترات من الحمض النووي سريع المزيج الأخضر من خلال البطين الثالث.
من هناك ، سيملأ المزيج كلا البطينين الجانبيين في الحويصلات القشرية. للتثقيب الكهربائي ، يتم استخدام أقطاب BTX الملقط البلاتينية ضع القطب الموجب باتجاه جانب القشرة التي سيتم تثقيبها بالكهرباء.
على سبيل المثال ، يجب أن يكون القطب الكهربائي أعلى الرأس للقشرة الظهرية. للحصول على كفاءة عالية في التعدي ، اضبط دائما تركيز الحمض النووي على ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر واستخدم الحمض النووي المعزول من إعداد Maxi. إذا لزم الأمر ، استخدم مجموعة خالية من السموم الداخلية لتنقية الحمض النووي بعد التثقيب الكهربائي.
احتضان الرأس على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تشريحه. من المهم جدا استخدام الكمية المناسبة من النبضات الكهربائية والتيار عند إجراء التثقيب الكهربائي لتجنب إتلاف الأدمغة الجنينية الأصغر سنا. بعد التثقيب الكهربائي ، تصبح الأنسجة هشة للغاية.
من المهم إجراء التشريح بعناية فائقة حيث يمكن للجلد والمدرسة سحب السحايا في الحويصلات القشرية ، وقد يؤدي ذلك إلى تلف الحويصلات القشرية عند إزالتها من الجمجمة. بعد خمس دقائق ، قم بتشريح الدماغ في البرد. يبدأ HBSS بعمل شق صغير على جانب الرأس وتقشير الجلد من جانبي الرأس.
بعد ذلك ، باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة البيا برفق من الدماغ. إزالة الدماغ السليم من الجمجمة. عند الانتهاء ، حافظ على الدماغ في HBSS البارد والاستعداد لتضمين الأنسجة.
ابدأ في ملء القوالب بنقطة انصهار منخفضة بنسبة 3٪. أغروس. ضع القوالب على الجليد حتى تصلب الأغروس بالقرب من قاع القالب. أولا ، التأكد من أن الأدمغة تظل مدعومة ومركزة.
الآن باستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة الدماغ برفق من HBSS ، وامتصاص المخزن المؤقت الزائد بمسح كيم أو ورق ترشيح ، واضبط الدماغ في نقطة الانصهار المنخفضة. أغروس. ثم استخدم طرف ماصة لتحريك الدماغ داخل القالب لزيادة التلامس بين الزراعة والأنسجة. مع نقل جميع الأدمغة ، ضع كل دماغ في نفس الاتجاه والعمق تقريبا داخل قالبه.
سوف تصلب الأروس في حوالي خمس دقائق. لذا اعمل بسرعة. اسمح للأروس بالتصلب تماما عن طريق احتضان خمس دقائق إضافية على الجليد.
تقليم الفائض قبل تركيب الكتل. ثم قم بإرفاق كتل agros ببعضها البعض باستخدام مادة لاصقة بلاستيكية سريعة الترابط ، يجب وضع كل دماغ في كومة مع بصيله الشمية لأعلى. بمجرد ربط الكتل ، قم بقص القوس للتأكد من تقطيع كل دماغ بواسطة الاهتزاز.
ثم اغمرها على الفور في HBSS المثلج. لتقطيع الكتل ، اضبط سرعة الاهتزاز على سرعة منخفضة ، حوالي نصف الحد الأقصى ، واضبط تردد اهتزاز الشفرة على أعلى إعداد. ثم قم بإنشاء شرائح إكليلية بسمك 250 ميكرون ، واسترجع الشرائح باستخدام ملعقة دقيقة مثنية ونقلها إلى آبار الأنسجة بفرشاة دقيقة أو ملقط.
إذا سقط النسيج من agros ، لم يتم تشكيل ملامسة الأنسجة الزراعية بشكل كاف في غطاء زراعة الأنسجة ، وقم بإعداد صفيحة بستة آبار مع 1.8 مل من وسائط زراعة الشرائح لكل بئر ، ووضع رمز إدراج النمط العضوي ليسين laminin polity lysine في كل منها. أضف جيدا 500 ميكرولتر من وسائط زراعة الشرائح إلى الجزء العلوي من إدخالات الشرائح العضوية. ثم انقل ما يصل إلى خمس شرائح لكل إدراج.
بعد ذلك ، قم بإزالة أي وسائط زائدة من أعلى الشرائح للتأكد من أن الشرائح تحافظ على مورفولوجيتها قدر الإمكان ولديها الحد الأدنى من موت الخلايا. من المهم الحفاظ على واجهة هواء سائل صحية وعدم تطفو الشرائح في الوسائط. أخيرا ، احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطوبة.
استبدل نصف حجم الوسائط الموجودة أسفل الغشاء كل يومين. لا ينبغي أن تطفو الشرائح على الوسائط ، ويمكن تصور الخلايا العصبية التي تعبر عن التركيبات الكهربائية في وقت مبكر يصل إلى ثماني ساعات بعد التثقيب الكهربائي بعد الأيام المرغوبة من الزراعة. إصلاح الشرائح في الغشاء لتحليلها.
اغسل كل ملحق عضوي نموذجي باستخدام PBS دافئ لمدة خمس دقائق. قم بإجراء ثلاث غسلات PBS في المجموع ، ثم قم بإصلاح الأنسجة باستخدام 4٪ ألدهيد بارافورم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد التثبيت ، يمكن تحليل الأنسجة بعلامات خلوية أو ببساطة تلطيخها بوصمة عار الخطافات بعد ساعة ، اغسل الشرائح بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في XPBS واحد.
ثم نفاذية الشرائح لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في محلول مصل الماعز بنسبة 10٪ في XPBS واحد مع رج لطيف. ثم تلطخ الأنسجة بخطافات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. قم بإزالة البقعة بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في XPBS واحد مع رج لطيف أثناء الانتظار.
ضع شرائح زجاجية بلورية في غرفة ماء عميقة بما يكفي لاستحمام المناديل بعد وضعها على الشرائح. لتركيب الشرائح. أولا ، قم بقطع الغشاء بمشريط.
ثانيا ، باستخدام ملقط دقيق ، انقل ما يصل إلى خمس شرائح مرتبطة بالغشاء إلى كل شريحة مغمورة في الماء. ثالثا ، قم بإزالة أي ماء زائد من كل شريحة. رابعا ، ضع قطرة من محلول التثبيت الأرضي على كل شريحة دماغية.
وأخيرا ، ضع غطاء برفق فوق الشرائح وقم بإزالة أي فقاعات هواء. ثم تكون الشرائح جاهزة للفحص المجهري اعتمادا على كمية الحمض النووي الكهربائي والمرحلة الجنينية. عند التثقيب الكهربائي ، وجد أن كفاءة التعداء تختلف.
بعد ثماني ساعات من التعدي باستخدام كاتم صوت P ، بدأت الخلايا المتجهة GFP في التعبير عن GFP. خلال فترة استزراع أطول ، تخضع الخلايا لتسلسل طبيعي من الأحداث العصبية بما في ذلك الانتشار والهجرة والتمايز العصبي المبكر. احتفظت هذه الشرائح بتشكلها لمدة خمسة أيام ، بشرط أن يتم الحفاظ على واجهة هواء الوسائط جيدا أثناء محاولة هذا الإجراء.
من المهم إجراء التجربة بأكملها من لحظة القتل الرحيم للحيوان إلى اللحظة التي يتم فيها وضع الشرائح في إدخالات الغشاء في أقل من ساعتين لتقليل موت الخلايا بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء أخرى مثل إضافة العوامل الخارجية إلى التحلل العضوي للإجابة على أسئلة مثل ، ما هو دور عوامل النمو المختلفة أو العوامل الدوائية في آليات النمو العصبي المختلفة؟
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتقييم وظيفة الجين في تطور القشرة الدماغية من خلال الكهربائي خارج الجسم الحي. باستخدام البلازميدات التي تعبر بشكل مشترك عن الحمض النووي الريبي المثبط وGFP، يمكن للباحثين التحقيق في عمليات النمو العصبي مثل التخلق العصبي وهجرة الخلايا العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- النمو العصبي
- علم الوراثة
الخلفية
- القشرة الدماغية ضرورية لوظائف الدماغ المختلفة.
- فهم وظيفة الجين ضروري للحصول على رؤى حول النمو العصبي.
- تتيح تقنيات خارج الجسم الحي دراسة مفصلية للسلوك العصبي.
- الكهربائي هو طريقة تستخدم لإدخال الحمض النووي في الخلايا.
غرض الدراسة
- لتقييم وظيفة الجين بسرعة في تطور القشرة الدماغية.
- لدراسة التخلق العصبي، هجرة الخلايا العصبية، والتشكل العصبي.
- لاستخدام الشرائح النمطية العضوية لمراقبة التغيرات العصبية.
الطرق المستخدمة
- الكهربائي خارج الجسم الحي للبلازميدات في القشرة الجنينية للفئران.
- استخدام اندفاعات كهربائية قصيرة لتسهيل الإدخال.
- تشريح وغرس الأدمغة لإنشاء شرائح نمطية عضوية.
- مراقبة الخلايا الموسومة بـ GFP لتحديد العيوب العصبية.
النتائج الرئيسية
- إدخال ناجح للخلايا السليفة العصبية بالبلازميدات.
- تحديد المجموعات الفرعية للخلايا العصبية القشرية التي بها عيوب.
- التحقق من فائدة التقنيات خارج الجسم الحي في النمو العصبي.
- تأكيد بصري لتطور الخلايا العصبية من خلال تسمية GFP.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة طريقة سريعة لدراسة وظيفة الجين.
- الكهربائي خارج الجسم الحي فعال للبحوث التنموية العصبية.
- الرؤى المكتسبة يمكن أن توضح فهم تطور القشرة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
