أساليب لدراسة التشكل متعلق بالخلايا العصبية:

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء تقييم سريع لوظيفة الجينات في تطور القشرة المخية باستخدام شرائح عضوية النمط. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال بلازميدات تعبر عن RNA مثبط وعلامة GFP في القشرة المخية للفأر. تُطبق نبضات كهربائية قصيرة على الدماغ، مما يسمح للحمض النووي البلازميدي بتحويل الخلايا السليفة العصبية.

بعد ذلك، يتم تشريح الأدمغة وتضمينها وتقطيعها لإنتاج شرائح عضوية النمط يمكنها الخضوع للتخلق العصبي خارج الجسم الحي. ويمكن البحث في الشرائح عضوية النمط عن المجموعات الفرعية من الخلايا العصبية القشرية التي تعاني من عيوب هجرية أو شكلية من خلال الملاحظة المباشرة للخلايا الموسومة بـ GFP. مرحباً بكم في مختبري بجامعة Brown في قسم البيولوجيا الجزيئية اليوم، حيث ستقوم الدكتورة Liza وطالبان، Kat Zer وMark Seba، باستعراض تقنية التثقيب الكهربائي خارج الجسم الحي وزراعة الشرائح عضوية النمط، وهي تقنية مفيدة جداً في دراسات التطور العصبي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في جوانب مختلفة من التطور العصبي، بما في ذلك تكوين الخلايا العصبية، وهجرة الخلايا العصبية، والتشكل العصبي. ونظراً لأن هذا التحليل يتم في بيئة تقريبية من وحدة التوليد البينية (IBU)، فإنه يوفر بديلاً منخفض التكلفة وسريعاً لإنتاج الحيوانات المعدلة وراثياً أو الحيوانات التي تعاني من تعطيل جيني للجينات ذات الوظائف غير المعروفة. وأخيراً، وبالمقارنة مع تقنية التثقيب الكهربائي في الجسم الحي، فإن نجاح تجارب التثقيب الكهربائي الحية هذه لا يعتمد على الجراحة الماهرة وتطوير المهارات، ويمكن تنفيذها في وقت تدريب أقصر وبمهارة أقل.

بعد القتل الرحيم لأنثى فأر حامل، يتم تشريح الأجنة وإخراجها في محلول HBSS كامل ومبرد بالثلج، مع إبقائها داخل أكياسها المشيمية الفردية. بعد ذلك، وفي محلول HBSS البارد، يتم تحرير الجنين من الكيس وقطع الرأس بعد الفقرة الأولى من أجل الحقن، ثم يوضع الرأس على قطعة من ورق البارافورم فوق طبق بتري باستخدام حقنة هاميلتون مخصصة. يتم حقن 6 إلى 8 µL من خليط DNA fast green عبر البطين الثالث.

من هناك، سيملأ الخليط كلا البطينين الجانبيين في الحويصلات القشرية. وبالنسبة للتثقيب الكهربائي، تُستخدم أقطاب بلاتينية من ملقط BTX. ضع القطب الموجب تجاه جانب القشرة الذي سيتم تثقيبه كهربائياً.

على سبيل المثال، يجب وضع القطب الكهربائي فوق الرأس بالنسبة للقشرة الظهرية. ولتحقيق كفاءة نقل عالية، يجب دائماً ضبط تركيز DNA ليكون 1 µg/µL واستخدام DNA مستخلص من Maxi prep. وعند الضرورة، استخدم طقم تنقية خالٍ من السموم الداخلية لتنقية DNA بعد عملية التثقيب الكهربائي.

قم بتحضين الرأس على الثلج لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تشريحه. من المهم جداً استخدام المقدار الصحيح من النبضات الكهربائية والتيار عند إجراء عملية التثقيب الكهربائي (electroporation) لتجنب إتلاف أدمغة الأجنة الأصغر سناً. بعد التثقيب الكهربائي، تصبح الأنسجة هشّة للغاية.

من المهم إجراء عمليات التشريح بعناية فائقة، حيث يمكن للجلد والجمجمة أن يضغطا على السحايا الخاصة بالحويصلات القشرية، مما قد يؤدي إلى تلف هذه الحويصلات عند إزالتها من الجمجمة. بعد مرور خمس دقائق، قم بتشريح الدماغ في محلول HBSS البارد، وابدأ بعمل شق صغير على جانب الرأس ثم قم بتقشير الجلد عن جانبي الرأس.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة الأم الجافية برفق من الدماغ. أخرج الدماغ السليم من الجمجمة. عند الانتهاء، احفظ الدماغ في محلول HBSS المبرد بالثلج واستعد لتضمين النسيج.

ابدأ بملء القوالب بنسبة 3% من Agar منخفض درجة الانصهار. ضع القوالب على الثلج حتى يتصلب الـ Agar بالقرب من قاع القالب، مع ضمان بقاء الأدمغة مدعومة وفي المركز أولاً.

الآن، وباستخدام ملقط دقيق، أخرج الدماغ برفق من محلول HBSS، وامتص المحلول الزائد باستخدام منديل Kimwipe أو ورقة ترشيح، ثم ضع الدماغ في هلام Agarose منخفض درجة الانصهار. بعد ذلك، استخدم رأس ماصة لتدوير الدماغ داخل القالب لضمان أقصى قدر من التلامس بين الـ agarose والأنسجة. بعد نقل جميع الأدمغة، قم بضبط كل دماغ في نفس الاتجاه والعمق تقريباً داخل قالبه.

سوف يتصلب الـ aros في غضون خمس دقائق تقريبًا، لذا يجب العمل بسرعة. اترك الـ aros حتى يتصلب تمامًا عن طريق تحضينه لمدة خمس دقائق إضافية على الثلج.

قم بقص الزوائد من مادة الـ aros قبل تثبيت الكتل. ثم قم بربط كتل الـ agros ببعضها البعض باستخدام مادة لاصقة بلاستيكية سريعة التصلب، مع وضع كل دماغ في الكومة بحيث تكون البصيلات الشمية متجهة للأعلى. وبمجرد تثبيت الكتل، قم بقص الـ aros لضمان تقطيع كل دماغ بواسطة جهاز الـ vibrato.

ثم قم بغمرها فوراً في محلول HBSS مبرد بالثلج. لتقطيع الكتل، اضبط سرعة جهاز الـ vibratome على سرعة منخفضة، حوالي نصف السرعة القصوى، واضبط تردد اهتزاز الشفرة على أعلى إعداد. بعد ذلك، قم بعمل شرائح إكليلية بسمك 250 micron، واستخرج الشرائح باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) دقيقة ومنحنية، وانقلها إلى آبار الأنسجة باستخدام فرشاة دقيقة أو ملقط.

إذا سقط النسيج من مصفوفة الأجار (agros)، فهذا يعني أن التلامس بين النسيج والأجار لم يتشكل بشكل كافٍ في غطاء زراعة الأنسجة؛ لذا قم بتجهيز طبق يحتوي على ستة آبار بوضع 1.8 ملليلتر من وسط زراعة الشرائح في كل بئر، وضع في كل بئر إدراجات عضوية (organotypic inserts) مطلية باللامينين والبولي لايسين. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الشرائح فوق الإدراجات العضوية للشرائح، ثم انقل ما يصل إلى خمس شرائح إلى كل إدراج.

بعد ذلك، قم بإزالة أي وسط زائد من أعلى الشرائح لضمان الحفاظ على مورفولوجيا الشرائح قدر الإمكان وتقليل موت الخلايا إلى أدنى حد. ومن المهم الحفاظ على واجهة سائلة هوائية سليمة وعدم ترك الشرائح تطفو في الوسط. وأخيراً، قم بحضن الشرائح عند 37 °C في حضانة رطبة.

استبدل نصف حجم الوسط الغذائي الموجود أسفل الغشاء كل يومين. يجب ألا تطفو الشرائح على الوسط الغذائي؛ حيث يمكن رؤية الخلايا العصبية التي تعبر عن البنى التي تم إدخالها بالتثقيب الكهربائي في وقت مبكر يصل إلى ثماني ساعات بعد التثقيب الكهربائي. بعد أيام الزرع المطلوبة، قم بتثبيت الشرائح في الغشاء لإجراء التحليل.

اغسل كل قطعة غرس نموذجية عضوية باستخدام PBS دافئ لمدة خمس دقائق. قم بإجراء ثلاث غسلات بـ PBS في المجمل، ثم ثبت النسيج باستخدام 4%paraform aldehyde لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات celsius. بعد التثبيت، يمكن تحليل الأنسجة باستخدام الواسمات الخلوية أو صبغها ببساطة بصبغة hooks. بعد مرور ساعة، اغسل الشرائح بثلاث غسلات مدة كل منها 10 دقائق في one XPBS.

ثم يتم نفاذ الشرائح لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في محلول مصل ماعز بنسبة 10% في 1X PBS مع الرج اللطيف. بعد ذلك، تُصبغ الأنسجة بـ hooks لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف. يتم إزالة الصبغة من خلال ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق لكل منها في 1X PBS مع الرج اللطيف أثناء الانتظار.

ضع شرائح زجاجية ذات وجه مُصنفر في وعاء مائي يكون عميقاً بما يكفي لغمر الأنسجة بعد وضعها على الشرائح. ولتثبيت المقاطع، قم أولاً بقطع الغشاء باستخدام المشرط.

ثانيًا، باستخدام ملقط دقيق، انقل ما يصل إلى خمس شرائح مرتبطة بالغشاء إلى كل شريحة زجاجية مغمورة في الماء. ثالثًا، قم بإزالة أي مياه زائدة من كل شريحة. رابعًا، ضع قطرة من محلول التثبيت (floor mount solution) على كل شريحة من شرائح الدماغ.

وأخيراً، ضع شريحة غطاء بلطف فوق الشرائح وقم بإزالة أي فقاعات هوائية. بعد ذلك، تصبح الشرائح جاهزة للفحص المجهري اعتماداً على كمية الـ DNA التي تم إدخالها عن طريق التثقيب الكهربائي والمرحلة الجنينية. وقد وُجد أن كفاءة عفن التحول تختلف عند التثقيب الكهربائي.

بعد ثماني ساعات من عملية عفن (transfection) باستخدام مُسكت P، بدأت خلايا ناقل GFP في التعبير عن GFP. وخلال فترة زراعة أطول، تمر الخلايا بتسلسل طبيعي من الأحداث العصبية بما في ذلك التكاثر والهجرة والتمايز العصبي المبكر. حافظت هذه الشرائح على شكلها المورفولوجي لمدة خمسة أيام، شريطة الحفاظ الجيد على الواجهة الهوائية للوسط أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء.

من المهم إتمام التجربة بأكملها، بدءاً من لحظة قتل الحيوان رحيماً وحتى لحظة وضع الشرائح في أدراج الغشاء، خلال أقل من ساعتين لتقليل موت الخلايا الناتج عن هذا الإجراء. يمكن إجراء خطوات أخرى، مثل إضافة عوامل خارجية إلى التحليل المنسجي للعضو، للإجابة على تساؤلات مثل: ما هو دور عوامل النمو المختلفة أو العوامل الدوائية في الآليات المختلفة للتطور العصبي؟