في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة النشاط العصبي عن طريق تصوير الكالسيوم بالتزامن مع ملاحظة سلوك التغذية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إدخال الذبابة في جهاز الذباب، ثم تشريح رأس الذبابة للكشف عن الدماغ.

يتم بعد ذلك وضع جهاز الذبابة مع الذبابة المشرحة على منصة المجهر. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحفيز Probus باستخدام فتيلة سكر. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تنشيط عصبون محدد من خلال تصوير الكالسيوم المرتبط بمد Probus عبر تسجيل السلوك بالفيديو.

لقد خطرت لي الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما فكرت في أعين حيوانات الخلد المائي التي تسبح على سطح الماء. تمتلك حيوانات الخلد المائي أعينًا منقسمة تمكنها من الرؤية فوق سطح الماء وتحته في آن واحد. وتكمن النقطة الحرجة في تجربتي في أن الدماغ ووحدات التحكم في الجمجمة (SCUs) متقاربان للغاية، ولكن إذا تم فصلهما بشكل جيد كما هو الحال في أعين حيوانات الخلد المائي، يمكننا الحفاظ على جفاف وحدات التحكم في الجمجمة (SCUs) بينما يكون الدماغ مكشوفًا في القمر الصناعي.

لقد صنعتُ حاجزاً بسيطاً جداً فوق وحدات التحكم في التحفيز (SCUs) مباشرةً لفصل الوجه الجاف عن مكان العرض. قم بتشكيل منصة من غطاء طبق فالكون سعة 35 مليمتر عن طريق صهر الجدار الجانبي ونحته لتشكيل الزاوية والسماكة المناسبتين. احفر ثقباً في المنصة لاستقبال رأس الذبابة، بحيث تكون أجزاء الفم مكشوفة بحرية إلى خارج الغرفة. اقطع طرف رأس ماصة بحيث يكون واسعاً بما يكفي لاستيعاب جسم الذبابة، ثم قم بلصق الرأس بالمنصة.

بعد تجويع ذبابة بالغة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 °C، يتم تخدير الذبابة بوضعها في أنبوب بلاستيكي سعة 15 milliliter، مع تثبيت الأنبوب على الثلج واستخدام الملاقط. أدخل الذبابة في غرفة الذباب وادفعها برفق حتى تصبح غير قادرة على الحركة.

قم بسد الأجزاء المحيطة بالخرطوم الداني أو المنقار عند الحافة الداخلية للفجوة عن طريق وضع كمية صغيرة من الغراء الذي يتم تصلبه بالضوء على الجوانب وفوق المنقار، مع استخدام رمش صناعي أو أداة مشابهة لتوزيع الغراء بعناية. قم أيضاً بوضع الغراء من داخل الذباب في المساحة الموجودة بين الجزء الظهري للرأس والحافة الداخلية للفجوة. وأخيراً، قم بتصلب الغراء باستخدام أضعف إضاءة من الضوء الأزرق تكون كافية للتصلب لتجنب إلحاق الضرر بالذبابة.

لتثبيت رأس الذبابة وكشف الجزء البطني من العقدة تحت المريئية (SOG)، قم بتثبيت خيط لإبقاء المخطم مرفوعاً جزئياً. وبمجرد وضع الذبابة في مكانها، املأ سطح المنصة بمحلول ملحي خالٍ من السكروز. افتح كبسولة الرأس للكشف عن العقدة تحت المريئية (SOG) باستخدام شفرة تنجستن وملقط ذي رؤوس مدببة، وهو ما نسميه الملقط المدبب.

مقصات scis zips. هذا عرض توضيحي لمقصات scis zips، حيث يتم قص ليفة من منديل Kim للمقارنة. يتم تنفيذ ذلك أولاً باستخدام مقصات القزحية (iris scissors) في المجال البصري، ثم أمام مسطرة مدرجة بدقة واحد مليمتر.

أولاً، باستخدام شفرة التنجستن، اصنع شقاً عبر الحافة الخلفية. ثم قم بالقص عبر الجوانب والحواف الأمامية باستخدام الملقط المدبب. ارفع قطعة الجلد الميت المقصوصة باستخدام الملقط وقم بإزالتها.

اقطع قرون الاستشعار وأعصابها باستخدام الملقط. ثم قم بإزالة الأكياس الهوائية الموجودة بين العقدة تحت المريئية (SOG) والكيوتيكل بشكل انتقائي من أجل تثبيت الدماغ ومنع حدوث تداخلات ناتجة عن الحركة. بعد ذلك، اقطع المريء عند الطرف المتجه نحو البلعوم وعند الطرف الذي يدخل إلى العقدة تحت المريئية (SOG) وذلك لإزالة الاتصال بين البلعوم والدماغ.

بعد ذلك، وبعد تحديد العضلة 16 وسحبها، قم بفصل أي قصيبة هوائية تربط الدماغ بالكيوتيكل. ضع الذباب على منصة المجهر البؤري ذو القرص الدوار، وقم بالتحويل إلى عدسة الغمر المائي للتصوير. ثم التقط مقطعًا بصريًا واحدًا بتردد 4 hertz وبزمن تعريض قدره 122 milliseconds باستخدام ليزر إثارة بطول موجي 491 nanometer مع التركيز على المنطقة المستهدفة.

استخدم إبرة حقنة بها فتيل صغير من ورق الياباني يبرز من الطرف لتقديم السكروز للذبابة. قم بتفريغ قطرة صغيرة من محلول السكروز على الفتيل، ثم اسحبها باستخدام حاقن متصل بالإبرة عبر أنبوب مرن، مع استخدام ذراع تحكم يدوي (joystick manipulator) لتثبيت الإبرة.

ضع فتيل الورق المبلل على طرف الـ probs، ولكن للحظة واحدة فقط، وذلك لتجنب التشبع. راقب استجابة تمدد الـ PROBUS أو سلوك الـ PER باستخدام كاميرا CCD متصلة بمجهر تشريح بالتزامن مع تصوير الكالسيوم، واحرص على جمع البيانات في غضون ساعة واحدة من عملية التشريح.

يظهر هنا استجابة نمطية لامتداد خرطوم (proboscis) عند التحفيز باستخدام محلول مائي مالح (WIC) يحتوي على 100 millimolar من السكروز. تم تصوير المحلول المائي باستخدام ليزر بطول موجي 491 nanometer لقياس فلورة G CAMP. ويسمح التصوير المتزامن للكالسيوم أثناء سلوك استجابة امتداد الخرطوم، الموضح هنا قبل التحفيز ثم بعده، بتصور استجابات GAMP 3.0 المستحثة بالسكروز في العصبون الحركي للعضلة الباسطة للمنقار (protractor of rostrum muscle).

في بداية مرحلة التحديد الكمي، يُظهر استجابة GAMP 3.0 المحفزة بالسكروز أن العصبونات الحركية تستجيب لمحفز السكروز من خلال زيادة حادة في الفلورة، تليها مرحلة استعادة تستمر لعدة ثوانٍ للعودة إلى الخط القاعدي. وتسمح منصة ذباب الفاكهة باستخدام طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية، أو الوراثة الضوئية، أو الوراثة النفسية، أو التنشيط الكيميائي للعصبونات، أو التصوير المخبري بنظام TimeLapse للهياكل الملحقة بـ GFP، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية مثل العلاقة بين اللدونة المشبكية والذاكرة.