الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تجميع واستخدام مستشعر مزدوج الوسم لتلف DNA يقوم بوسم نوعين رئيسيين من كسور DNA في المقاطع النسيجية. يتكون المستشعر من قليل نيوكليوتيد DNA من نوع 30 tumor، موسوم مزدوجاً بـ ZI و Rumine، وإنزيم vaccinia topo isomerase one أو vac topo الذي يتجمع ذاتياً. عندما يرتبط VAC topo بـ 30 tumor، تبدأ العملية التشغيلية عندما يقوم topo بقطع قليل النيوكليوتيد عند الطرف الثلاثي ' (three prime end) لتسلسل التعرف، مما ينتج عنه وحدة fitzy موسومة ومنشطة من vac topo ودبوس شعر (hairpin) حر موسوم بالأمين.

بوجود مجموعة هيدروكسيل نهائية في الطرف '3، تكون الوحدات قصيرة العمر ويُعاد تجميعها بسرعة إلى البنية الأصلية، التي يتم شطرها لاحقاً. وفي حالة عدم وجود كسور إضافية في الحمض النووي الجزيئي، تنفصل هاتان الوحدتان وتتحدان باستمرار بطريقة دورية. وعند تطبيق المستشعر الجزيئي على مقاطع نسيجية تعاني من تلف في الحمض النووي، تلتصق وحدة الكاشف الموسومة بـ Fitz بشكل انتقائي بكسور الحمض النووي ذات النهايات غير المسننة التي تحتوي على مجموعة هيدروكسيل في الطرف '5.

ستقوم وحدة الكشف المسمىة بـ R domine بربط كسر blunt ended يحتوي على فوسفات في الطرف الخماسي. وفي حال وجود T four DNA Ligase، يتم الحصول على نتائج تظهر وجود وتوزيع كسور الحمض النووي DNA من النوع one والنوع two في الخلايا بناءً على المجهر الفلوري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية للكشف عن HESIs مثل tunnel في كونها أكثر نوعية وتوفر معلومات إضافية من خلال تمييز كل من مرحلتي موت الخلايا المبرمج الذاتي والمؤكل.

من منظور تقنية النانو، يمثل هذا المستشعر نهجاً مدعوماً حيوياً يكيف البنى والهياكل البيولوجية الفعلية لإنشاء أجهزة غير سامة على المقياس الجزيئي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن نجاحها يعتمد على استخدام تحضير عالي النشاط من Toro SOM والمعالجة الصحيحة للمقاطع لتجنب الهضم المفرط بواسطة proteinase K. يجب تحضير مقاطع الأنسجة لهذا الإجراء قبل تجميع الجهاز الجزيئي. يتم قطع مقاطع بسمك يتراوح من خمسة إلى ستة ميكرون من paraldehyde.

يُوصى باستخدام كتل الأنسجة المثبتة والمطمورة في البارافين. ضع الشريحة التي تحتوي على مقطع النسيج في حامل شرائح وقم بإزالة الشمع باستخدام الزايلين لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، انقل الشرائح إلى حمام زايلين جديد لمدة خمس دقائق إضافية.

أعد ترطيب المقطع عن طريق تمرير الشريحة عبر تركيزات الإيثانول المتدرجة التالية: إيثانول 96% مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة، ثم إيثانول 80% لمدة خمس دقائق، يليه الماء.

مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد إعادة الترطيب، يتم هضم المقطع باستخدام proteinase K. وباستخدام 100 µL من محلول بتركيز 50 µg/mL لكل مقطع، يتم التحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة. وبناءً على نوع النسيج، قد يتطلب وقت الهضم تعديلاً، ولكن يجب الحذر من الهضم المفرط لأنه يؤدي إلى اختفاء الإشارة وتلف المقطع عند اكتمال عملية الهضم.

اشطف الشريحة بالماء المقطر مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة. ضع BSA بنسبة 2% من أجل الحجب المسبق، ثم قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة. خلال هذا الوقت، قم بتجميع الآلة الجزيئية كما هو موضح لاحقاً في هذا الفيديو.

تم قياس جميع الكاشفات المستخدمة في تجميع الآلة الجزيئية ليكون الحجم الإجمالي 25 µL، وهو حجم كافٍ لعملية كشف واحدة في مقطع نسيجي متوسط الحجم. يمكن زيادة هذا الحجم حسب الحاجة في أنبوب بلاستيكي صغير. اخلط الكاشفات التالية بهذا الترتيب باستخدام الماء المقطر.

يتم خلط 15%polyethylene glycol 8, 000 T four DNA Ligase buffer، وقليل من النيوكليوتيدات ثنائية الوسم vaccinia topoisomerase one وT four DNA Ligase برفق عن طريق الماصة. سيتجمع التركيب الجزيئي ذاتياً بشكل فوري تقريباً في هذا المحلول، ويمكن استخدامه مباشرة في درجة حرارة الغرفة. لبدء إجراء وسم كسور DNA، يتم سحب محلول الحجب المسبق من الشريحة.

ضع 25 µL من مزيج التفاعل الكامل في كل مقطع. ضع غطاءً بلاستيكيًا فوق المقطع ثم ضع الشريحة في غرفة مرطبة. احمِ الشريحة من الضوء بتغليف الغرفة بورق ألومنيوم، ثم قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

على الرغم من إمكانية ملاحظة إشارات الـ ligase والـ topo بعد فترة تحضين لمدة ساعة واحدة، إلا أنه يمكن في كثير من الحالات تعزيز إشارة الـ ligase بشكل أكبر. ولتعزيز الإشارة، أعد وضع خليط التفاعل بدون vac topo و oligonucleotide one، ولكن مع إضافة oligonucleotide three و T four DNA Ligase، ثم ضع غطاءً بلاستيكياً على المقطع وحضنه في غرفة رطبة لمدة 18 ساعة. وفي اليوم التالي، وفي درجة حرارة الغرفة، اغمر الشريحة برفق وبشكل عمودي في وعاء coplan يحتوي على ماء بدرجة حرارة الغرفة لإزالة الغطاء البلاستيكي.

بعد ذلك، اغسل المقطع بالماء المقطر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. اشطف المقطع بمحلول بيكربونات الصوديوم المنظم. يعمل شطف المحلول القلوي هذا على تعزيز فلورية fitzy، والتي تتأثر بالرقم الهيدروجيني pH وتنخفض بشكل ملحوظ عندما يكون الرقم الهيدروجيني pH أقل من سبعة.

أخيراً، قم بتغطية المقطع بمحلول مضاد للتلاشي يحتوي أيضاً على DPI لعدّ وصب الأنوية، ثم ضع شريحة غطاء. أصبحت المقاطع الآن جاهزة للفحص بالمجهر الفلوري. يظهر في هذا الشكل مقطع نسيجي من غدة زعترية عولجت بالديكساميثازون، حيث رصدت الآلة الجزيئية كسور الحمض النووي ذات النهايات المسطحة من نوع DNAs one و DNAs two في المناطق القشرية للغدة الزعترية التي تمر بعملية الموت الخلوي المبرمج؛ حيث يشير الفلوريسنت السيتوبلازمي الأخضر إلى الكسور من نوع DNA's two، والتي تميز البلاعم القشرية التي تهضم المادة النووية للخلايا الزعترية المبرمجة.

يتم إنتاج هذه الإشارة بواسطة vac topo وتتمركز في lysosome FGA التي تحتوي على DNA ذو مجموعة هيدروكسيل في الطرف الخماسي. تشير الفلورة الحمراء لكسور الشريط المزدوج إلى علامات نوع واحد من كسور DNA، في نوى الخلايا التيموسية المبرمج موتها والتي لم تبتلعها البلاعم. تخضع أعداد هائلة من الخلايا التيموسية للموت الخلوي المبرمج في آن واحد.

يصاحب ذلك توليد خمسة كسور مزدوجة السلسلة من الفوسفات الأولي تم تصورها عن طريق الوسم المعتمد على الليغيز. تقع هذه الكسور عند المحيط النووي وتشكل أنماطاً حلقية الشكل. تظهر جميع النوى الخلوية باللون الأزرق من خلال التصبيغ المقابل باستخدام dpi.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم السماح للمقاطع بأن تجف بين إضافات المحاليل المختلفة. كما يجب الاحتفاظ بجميع التحضيرات الإنزيمية على الثلج قبل إضافتها إلى المقاطع، وحماية المجسات الفلورية من الضوء أثناء تفاعل الوسم بعد تطويره. وقد سمحت هذه التقنية بتصوير جميع مراحل تفكك خلايا heto.

يعد هذا المستشعر في حد ذاته مثالاً على نهج التكنولوجيا النانوية الخضراء في تصميم الجسيمات والمجسات والآلات النانوية. يجمع هذا النهج بين المكونات الاصطناعية وأجزاء الآلات الجزيئية الموجودة طبيعياً. والهدف من ذلك هو القضاء على السمية والتفاعلية البيولوجية الضارة لهذه المواد النانوية عالية التشتت.