العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

الهدف من هذا البروتوكول هو عزل وتوسيع خلايا ورم الأرومة الدبقية متعدد الأشكال البشري باستخدام أصل الكرات العصبية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فرم نسيج الورم المستأصل، يليه التفكيك الميكانيكي، وأخيرًا زراعة الخلايا الناتجة لتنمو في مستنبت الكرات العصبية. سنقوم في هذا الفيديو بتوضيح كيفية عزل وتوسيع الخلايا الشبيهة بالجذعية من نسيج ورم الأرومة الدبقية البشري باستخدام طريقة مستنبت الكرات العصبية.

يمكن استخدام هذه الطريقة أيضاً لاستزراع خلايا من أورام دماغية أخرى، بالإضافة إلى الأورام الصلبة مثل أورام الثدي والبروستاتا والكبد والرئة. حسناً، لنبدأ. بعد استلام نسيج ورم GBM المستأصل جراحياً، يتم إزالة الوسط الغذائي.

يُغسل الورم مرتين أو ثلاث مرات باستخدام PBS معقم لإزالة الملوثات مثل الدم والحطام الخلوي. بعد الغسل، يوضع الورم المستأصل في طبق بتري معقم. أولاً، يُقطع الورم إلى أجزاء أصغر، ثم تُنقل قطعة من نسيج الورم إلى طبق بتري منفصل، ويُفرم النسيج باستخدام مشرط رقم 10 إلى قطع صغيرة جداً.

سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح المتاحة للتفكك الإنزيمي. قد تستغرق عملية الفرم من دقيقة إلى ثلاث دقائق اعتماداً على حجم الورم. الآن، أضف من 3 إلى 5 ml من التريبسين المسخن مسبقاً إلى النسيج المفروم وانقله إلى أنبوب فالكون معقم سعة 15 ml.

ضع أنبوب الـ 15 Ml في حمام مائي عند 37 درجة لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. رج الأنبوب كل خمس دقائق. ولضمان هضم أفضل للأنسجة، أضف حجماً مساوياً من مثبط التريبسين لإيقاف التفاعل.

يتم ضمان تنشيط التريبسين عن طريق السحب والطرد بالماصة عدة مرات. تُطرد المعلق مركزياً عند 800 RRP M أو 110 G لمدة خمس دقائق. يتم التخلص من supernatant، ثم يُعاد تعليق pallet في 1 ml من الوسط الأساسي للخلايا الجذعية العصبية، مع وضع طرف الماصة مقابل قاع الأنبوب.

استخدم الماصة للسحب والدفع من ثلاث إلى سبع مرات لتفكيك التكتلات حتى يتم الحصول على معلق حليبي، حيث أن الإفراط في عملية الماصة قد يؤدي إلى موت الخلايا. ضع مرشحاً بمسامية 40 micron على أنبوب سعة 50 ml. أضف الآن من 10 إلى 15 ml من الوسط الأساسي (basal medium) إلى معلق الخلايا واخلطه برفق، ثم مرر معلق الخلايا عبر المرشح بمسامية 40 micron لإزالة الحطام والتكتلات غير المرتبطة.

قم بطرد الخلايا مركزياً ثم اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة التفريغية. أعد تعليق الخلايا في 1 إلى 2 mls من الوسط الغذائي الكامل. بعد ذلك، استخدم الماصة بلطف لسحب السائل ودَفعه للأعلى وللأسفل لضمان تجانس المعلق.

امزج 10 µL من معلق الخلايا في 90 µL من صبغة Trypan blue. اخلط المعلق جيداً وانقل 10 µL إلى مقياس كرات الدم (hemo.Cytometer). قم بإجراء عد للخلايا كما هو موضح هنا.

يتطلب الحصول على عدد دقيق للخلايا توفير معلق من الخلايا المفردة الخالية من التكتلات. لا تدرج الخلايا التي تظهر نتيجة إيجابية مع صبغة tripan blue عند العد من أجل زراعة الخلايا في قارورة T 80.

أضف 20 ml من وسط زراعة الخلايا الجذعية العصبية الكامل إلى أنبوب سعة 50 ml. أضف الكمية المناسبة من معلق الخلايا للوصول إلى كثافة تبلغ 200, 000 خلية لكل ml. الآن أضف EGF للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 nanogram لكل ml.

أضف الهيبارين بنسبة 0.2% بتركيز 1 µL لكل ml. وأخيرًا، أضف BFGF للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 ng لكل ml. اخلط الخلايا في وسط غذائي كامل مُدعّم بعوامل النمو.

بعد ذلك، يتم نقل المعلق إلى دورق T 80 مُصنف، ثم يُنقل الدورق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5%CO2 لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أيام. وبعد ثمانية أيام من الزرع، تكون الكريات قد نمت بالكامل وأصبحت جاهزة لعملية الممررة.

اجمع محتويات الدورق وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ml. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 800 RPM لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي باستخدام الشفط، ثم أعد تعليق الراسب في 1 ml من التربسين المسخن مسبقاً.

قم بتحضين الخلايا في حمام مائي عند 37 °C لمدة دقيقتين. أضف كمية مساوية من مثبط التربسين واخلط جيداً لضمان التنشيط. بعد ذلك، قم بترسيب الخلايا.

قم بإزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في 1 ml من الوسط الغذائي الكامل، ثم اسحب السائل بالماصة للأعلى وللأسفل بلطف لضمان تجانس معلق الخلايا. قم بإجراء عد للخلايا كما هو موضح سابقاً من أجل زراعة الخلايا في دورق T 80 باستخدام 20 ml من الوسط الغذائي الكامل في أنبوب سعة 50 ml. أضف كمية مناسبة من معلق الخلايا للوصول إلى كثافة تبلغ 50,000 خلية لكل ml.

أضف الآن عوامل النمو بما في ذلك E-G-F-B-F-G-F، والهيبارين بالتركيز الموصوف سابقاً. اخلط معلق الخلايا الناتج برفق، ثم انقل المعلق إلى T 80 وضعه في الحاضنة لمدة تتراوح من 7 إلى 10 أيام. إليكم مثال على زراعة أولية لـ GBM.

بعد مرور أربعة أيام في هذه المرحلة، يمكنك ملاحظة أن الخلايا تتكاثر وبدأت في تكوين كرات. يجب ألا تلاحظ وجود تجمعات خلوية كروية كبيرة في هذه المرحلة، حيث إن ظهورها يكون ناتجاً عن تحضير غير مناسب للأنسجة.

بعد بقائها في المزرعة لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أيام، تتشكل كرات ذات أحجام متفاوتة، وعندما يصل متوسط قطر هذه الكرات إلى 150 إلى 200 ميكرون، تصبح جاهزة لنقل المزرعة (passage). هذا مثال على نقل مزرعة GBM بعد ثمانية أيام. ومرة أخرى، يمكنك رؤية كرات بأحجام متفاوتة، حيث تظهر الكرات السليمة نتوءات دقيقة على محيطها.

يعد تحضير معلق من الخلايا المفردة مسألة بالغة الأهمية في أي مزارع كروية. وخلاف ذلك، قد ينتهي بك الأمر بملاحظة تجمعات خلوية حتى في اليوم التالي لزراعة الخلايا. ويمكن اعتبار هذه التجمعات كرويات، ولكن تجدر الإشارة إلى أن تكوين الكرويات الحقيقية من الخلايا المثقبة يستغرق أسبوعاً واحداً على الأقل.

تختلف كمية الحطام في مستنبتات الكرات الورمية الأولية بناءً على عوامل عديدة، مثل مصدر النسيج ومدى دقة استئصاله، بالإضافة إلى تقنية معالجة النسيج. نأمل أن تجدوا هذا الفيديو مفيداً ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.