تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طريقة تُعرف باسم تنقية الألفة الترادفية لعزل البروتينات الشريكة الرابطة. مرحباً، أنا dLAN Bailey من قسم علم الفيروسات في كلية إمبريال لندن. نعمل في مختبرنا على دراسة التفاعلات بين الفيروس والعائل لأعضاء مختلفين من العائلة الفيروسية.

يُعد تحديد البروتينات التي تتفاعل مع بروتينات خلوية أو فيروسية أخرى نقطة بداية رائعة لاستقصاء التداخل بين الفيروس وعائله أثناء العدوى. في هذا الفيديو، سأشرح نهجاً نستخدمه في مختبرنا، وهو التنقية الترادفية والتقاط الألفة (tandem affinity purification) أو وسم TAP. يتكون وسم TAP المستخدم في هذه الدراسة من وسم في الطرف النتروجيني (N terminal) يتألف من وحدتين من البروتين G وببتيد رابط للستريبتادين (strep avidin).

يتم الفصل بين هذه المكونات عن طريق تسلسل قطع بروتياز TEV الذي يسمح باستخلاص محدد لبروتين الطعم. في هذا المثال، يقع EIF four E الفأري عند الطرف الكربوكسيلي (C terminus) لهذا البناء المدمج. يتكون بروتوكول وسم tap من إجراء مكون من ست خطوات.

بعد عملية عفن الخلايا (transfection) وإنشاء الخطوط الخلوية، يتم تحفيز الخلايا للتعبير عن بروتين الوسم abate قبل وضعها في محلول تحلل خفيف. تُستخدم خطوتان من التنقية بتقارب ومحلولان محددان لتنقية الطُعم وأي شركاء تفاعل محتملين لإنشاء الخطوط الخلوية. يجب عفن خلايا HEC 2 93 باستخدام ناقل التعبير P met four المشفر.

يتم بعد ذلك اختيار خلايا البروتين الطُعم الموسومة بـ tap باستخدام 100 µg/ml من الـ hygromycin B. وبما أن البلازميد يتم الحفاظ عليه كإبيسوم (episo)، فلا داعي لعزل مستعمرات محددة. يتم تحفيز 10 دوارق من الخلايا المتراصة عن طريق المعالجة بـ 10 µM من كلوريد الكادميوم لمدة 16 ساعة قبل كشطها في الوسط الغذائي. ثم تُنقل الخلايا المعلقة إلى أنابيب 15 mL ويتم تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

تُغسل هذه الخلايا بعد ذلك ثلاث مرات باستخدام PBS بارد جداً قبل تجميعها في النهاية عن طريق الطرد المركزي. الخطوة الثانية: تحلل الخلايا؛ يتم تحلل الخلايا في 5 mL من محلول التحلل (lysis buffer) البارد عن طريق السحب المتكرر بالمصّة قبل تركها على الثلج لمدة خمس دقائق. ولضمان التحلل الفعال، يتم بعد ذلك تمرير الخلايا عبر إبرة غير مدببة ذات قياس ضيق، ثم تعريضها لدورات التجميد والإذابة.

يتم توزيع المحلول الناتج في أنابيب سعة 1.5 ml، ثم تُزال الخلايا غير المتحللة والبقايا عن طريق الطرد المركزي. ومن الملاحظ أن حجم الراسب ينخفض بشكل ملحوظ بعد خطوة الطرد المركزي هذه. بعد ذلك، تُجمع الرواسب الطافية للمحلل في أنبوب Falcon سعة 15 ml وتُمرر عبر مرشح بمسامية 0.45 micrometer لإزالة أي بقايا إضافية.

يجب أخذ حصص مقدارها 50 µL من هذه المادة المتحللة لإجراء التحليلات اللاحقة. ويُشار إلى هذه العينة باسم العينة الأولى. الخطوة الثالثة، الارتباط بـ rabbit IgG Aeros.

في هذه المرحلة من البروتوكول، يتم تريب إرساب البروتينات الموسومة بـ protein G باستخدام خرزات IgG الأرنب. لتوزيع خرزات aros، قم بإزالة طرف رأس الماصة، حيث يساعد ذلك في تجنب إتلاف الخرزات.

أعد تعليق محلول rabbit IgG aro بلطف عن طريق تدوير الزجاجة قبل نقل الـ aros إلى أنبوب سعة 15 مل. اغسل الـ aros ثلاث مرات في محلول lysis buffer مبرد باستخدام الطرد المركزي بسرعة منخفضة لتنقية الخرزات في كل خطوة. يجب أن تكون حبيبات rabbit IgG المترسبة مرئية بعد عملية الطرد المركزي.

بعد كل خطوة، قم بإزالة المحلول المنظم بعناية دون تحريك الخرزات. بعد اكتمال الغسلة الأخيرة، أضف ناتج التحلل المفلتر والمروق إلى الخرزات المعبأة واتركه ليحضن لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل. ويُفضل أن يكون ذلك عند درجة حرارة 4 °C باستخدام خلاط دوار.

بعد عملية الترسيب المناعي، قم بإجراء عملية طرد مركزي لكرات الأجاروز وأزل السائل الطافي لإجراء التحليلات اللاحقة. وإذا لزم الأمر، يمكنك استخدام رأس ماصة دقيق لإزالة أي سائل متبقٍ في هذا الأنبوب. يمثل هذا السائل الطافي العينة الثانية للخطوة الرابعة من عملية القطع بواسطة إنزيم TEV protease.

في هذه الخطوة، يتم فصل الطعم عن علامات البروتين G. تسمح هذه الخطوة بالقطع النوعي لبروتين الطعم، وهي بمثابة خطوة شطف من ترسيب IgG الخاص بالأرانب المناعي. قم بتحضير خليط القطع TEV وأضفه إلى حبيبات aros باستخدام طرف ماصة تم إزالة نهايته، ثم انقل هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مُسيليكون، واقلبه لخلط aros في المعلق قبل الحضانة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، ثم خذ عينة من تفاعل القطع TEV هذا لإجراء التحليل.

هذه هي العينة الثالثة. من المفترض أن تسمح الحضانة طوال الليل على الخلاط الدوار بتطور تفاعل TEV حتى يقترب من الاكتمال. الخطوة الخامسة، الربط لتثبيت خرزات strept avidin.

في هذه الخطوة، يتم تنقية طُعم Cleve وأي شركاء ارتباط محتملين باستخدام التنقية الألفينية من المحلول. أولاً، قم بطرد مركزي لتفاعل قطع TEV الذي يحتوي على حبيبات aros rabbit IgG. لترسيب حبيبات aros، قم بإزالة كمية محددة من السائل الطافي المصفى لإجراء التحليل.

هذه هي العينة الرابعة. قم بإزالة كل ما تبقى من السائل الطافي، والذي يحتوي على بروتين الطعم، بعناية وانقله إلى أنبوب جديد. مرة أخرى، استخدم.

قم ببناء رؤوس الماصات (pipette tips) لإزالة جميع السوائل الطافية الممكنة. احتفظ بخرزات rabbit IgG aros للتحليل اللاحق. هذه هي العينة الخامسة.

لمنع تلف حبيبات strep adin، قم بإزالة الطرف من رأس ماصة pet. أعد تعليق الحبيبات بلطف وانقل كمية aliquot إلى أنبوب سيليكوني. اغسل حبيبات strep having باستخدام منظم S buffer، مع الترويق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.

بعد كل عملية غسيل. بعد كل عملية غسيل، قم بإزالة المحلول المنظم بعناية. حبيبات الستربتادين صغيرة جداً ويمكن إزاحتها بسهولة حتى عند استخدام ماصة دقيقة.

قم ببناء نصائح الحيوانات الأليفة. بعد غسل خرزات strept adin، أضف السائل الطافي من تفاعل cleavage الخاص بـ TEV إلى هذه الخرزات واحضن التفاعل لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، باستخدام خلاط دوار.

بعد الحضن، يتم إجراء الطرد المركزي لترسيب حبيبات streptavidin وإزالة السائل الطافي. هذه هي العينة السادسة. ملاحظة.

يرتبط بروتين الطعم الآن بالخرزات المتبقية في الأنبوب. اغسل خرزات الستربتافيدين التي تحتوي على بروتين الطعم باستخدام محلول التحلل. ولإزالة أي بروتينات ملوثة إضافية، قم بإزالة محلول الغسيل المتبقي من الخرزات واتركها في الثلج.

الخطوة السادسة، شطف البيوتين. في هذه الخطوة، يُضاف البيوتين إلى حبيبات الستريبتيفيدين. ويؤدي التفاعل بين البيوتين وحبيبات الستريبتيفيدين إلى إزاحة الطُعم، الذي يعود بدوره إلى المحلول.

أضف محلول البيوتين مباشرةً إلى الحبيبات واقلب الأنبوب للمزج. قم بتحضين التفاعل عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل باستخدام جهاز طرد مركزي دوار، ثم امزج خليط البيوتين واجمع الخليط بعناية في أنبوب جديد. هذا هو اختبار المناعة الإنزيمي (EIT) النهائي المشار إليه بالعينة رقم 7.

تُعتبر خرزات strept havein المتبقية هي العينة الثامنة. ونظراً لانخفاض تركيز البروتين فيها، يجب تركيز هذا الناتِج النهائي قبل التحليل. يتم تحقيق ذلك باستخدام أعمدة طرد مركزي ذات حد قطع للوزن الجزيئي المنخفض، حيث يتم تقليل الحجم عن طريق الطرد المركزي مع مراقبة العملية بانتظام.

يمكن تقسيم هذه العينة المركزة وتحليلها باستخدام هلامات SDS page عن طريق صبغتي كوماسي والفضة. وإذا كان سيتم تحليل العينات بواسطة مطياف الكتلة، فإننا ننصح باستخدام هلامات تجارية مسبقة الصب. بعد ذلك، يمكن استخلاص الحزم الفردية وتحديد البروتينات بواسطة مطياف الكتلة.

في هذه الحالة، كان الطُعم فؤارياً، وهو عبارة عن EIF لبروتين E. وتكمن ميزة نظام tap في قدرتك على التعبير عن البروتين المستهدف في خط خلوي محدد، وبناءً على الخط الخلوي الذي تهتم به، يمنحك النظام أيضاً القدرة على التعبير عن البروتين بمستويات منخفضة نسبياً إذا قررت ذلك، مع الاحتفاظ بجميع تعديلات ما بعد الترجمة والتمركز الخلوي، مما يتيح لك غالباً تنقية المعقد الأصلي.