تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية
February 25th, 2012
جنبا إلى جنب تقارب تنقية هو نهج قوي للتعرف على شركاء بروتين ملزمة. كدليل على المفهوم، تم تطبيق هذه المنهجية على eIF4E ترجمة جيدة تتميز عامل البدء إلى راسب المشترك العوامل الخلية المضيفة المشاركة في بدء الترجمة. ويتم تكييف هذه الطريقة بسهولة إلى أي بروتين خلوي أو فيروسي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طريقة تعرف باسم تنقية التقارب الترادفي لعزل شركاء ربط البروتين. مرحبا ، أنا dLAN Bailey من قسم علم الفيروسات في إمبريال كوليدج لندن. في مختبرنا ، نعمل على تفاعلات مضيف الفيروسات لأعضاء مختلفين من عائلة الفيروسات.
يعدتحديد البروتينات التي تتفاعل مع البروتينات الخلوية أو الفيروسية الأخرى نقطة انطلاق رائعة للتحقيق في التفاعل بين الفيروس ومضيفه أثناء الإصابة. في هذا الفيديو ، سأشرح أحد الأساليب التي نستخدمها في مختبرنا ، التنقية الترادفية والإلكترونية أو وضع العلامات على الصنبور. علامة Tap المستخدمة في هذه الدراسة هي علامة N طرفية تتكون من وحدتين من البروتين G وببتيد ربط البكتيريا العقدية.
يتم فصلها عن طريق تسلسل انقسام البروتياز TEV الذي يسمح بشطف محدد لبروتين الطعم. في هذا المثال ، يوجد murine ، EIF four E عند الطرف C لبناء الاندماج هذا. بروتوكول وضع العلامات على النقر هو إجراء من ست خطوات.
بعد التعدي وتوليد خطوط الخلايا ، يتم حث الخلايا على التعبير عن بروتين تخفيف العلامة قبل أن تقع في مخزن مؤقت خفيف للتحلل. يتم استخدام خطوتين لتنقية التقارب وحلولين محددين لتنقية الطعم وأي شركاء متفاعلين محتملين لتوليد خطوط الخلايا. يجب نقل خلايا HEC 2 93 باستخدام ترميز متجهات التعبير الأربعة P.
ثم يتم اختيار خلايا بروتين الطعم الموسومة بالصنبور بمائة ميكروغرام لكل مل هيغروميسين ب.نظرا للحفاظ على البلازميد episo ، فلا داعي لعزل نسخ معينة. يتم تحفيز 10 قلاعة متجانسة من الخلايا عن طريق المعالجة ب 10 كلوريد كاديوم ميكرومولار لمدة 16 ساعة قبل كشطها في الوسائط. ثم يتم نقل الخلايا العالقة إلى أنابيب 15 M ويتم تكويب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
ثم يتم غسل هذه الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج البارد قبل أن يتم تكويرها في النهاية. تقع خلايا تحلل الخلية في الخطوة الثانية في خمسة مليل من محلول التحلل البارد عن طريق سحب العينات المتكرر قبل تركها على الجليد لمدة خمس دقائق. لضمان التحلل الفعال ، يتم بعد ذلك حقنة الخلايا من خلال مقياس ضيق وإبرة حادة وذوبان الجليد.
يتم تخصيص الساتيت الناتج في أنابيب 1.5 مل وخلايا unli والحطام التي تتم إزالتها عن طريق الطرد المركزي. وتجدر الإشارة إلى أن حجم الحبيبات قد انخفض بشكل ملحوظ بعد خطوة الطرد المركزي هذه. ثم يتم دمج المواد الطافية المحللة في أنبوب فالكون سعة 15 مل ويتم تمريرها عبر مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة أي حطام إضافي.
يجب أخذ 50 ميكرولتر من هذا المحلل للتحليل اللاحق. يشار إلى هذه العينة باسم العينة الأولى. الخطوة الثالثة ، ملزمة للأرنب IgG Aeros.
في هذه المرحلة من البروتوكول ، يتم ترسيب علامات البروتين G المناعية بواسطة الأرانب IgG aros. لتخصيص حبات aros ، قم بإزالة نهاية طرف. هذا يساعد على تجنب إتلاف الخرز.
أعد تعليق محلول IgG aro للأرانب برفق عن طريق تحريك الزجاجة قبل إزالة الأروس إلى أنبوب سعة 15 مل. اغسل الأروس ثلاث مرات في عازلة التحلل المبردة باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة لتوضيح الخرزات في كل خطوة. يجب أن تكون حبات IgG للأرانب المحببة مرئية بعد الطرد المركزي.
بعد كل خطوة ، قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية دون إزعاج الخرز. بعد اكتمال الغسيل النهائي ، أضف المحللة المفلترة والمصفوفة إلى الخرزات المعبأة واحتضانها لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل. يفضل عند أربع درجات مئوية باستخدام خلاط دوار.
بعد الترسيب المناعي ، قم بتدوير حبات agros وإزالة المادة الطافية لتحليلها لاحقا. إذا لزم الأمر ، يمكنك استخدام طرف بناء ناعم لإزالة أي سائل متبقي من هذا الأنبوب. هذا المادة الطافية عبارة عن عينة من خطوتين الرابعة انقسام البروتياز TEV.
في هذه الخطوة ، يتم قطع الطعم من علامات البروتين G. تسمح هذه الخطوة بانقسام محدد لبروتين الطعم بشكل فعال خطوة شطف من الأرانب IgG يثير الترسيب المناعي. قم بإعداد مزيج الانقسام TEV وأضفه إلى حبات aros باستخدام طرف مع إزالة نهايته ، وانقل هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من السيليكون وقم بقلبه لخلط aros في التعليق قبل الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة alico من تفاعل الانقسام TEV هذا للتحليل.
هذه هي العينة الثالثة. يجب أن يسمح الحضانة الليلية على الخلاط الدوار لتفاعل TEV بالتقدم حتى الاكتمال تقريبا. الخطوة الخامسة ، ملزمة لشل حركة حبات الدين الستربت.
في هذه الخطوة ، يتم تنقية طعم Cleve وأي شركاء ملزمين محتملين من المحلول. أولا ، جهاز الطرد المركزي تفاعل انقسام TEV الذي يحتوي على حبات IgG الأرنب. لحبيبات aros ، قم بإزالة OTT من المادة الطافية الموضحة للتحليل.
هذه هي العينة الرابعة. قم بإزالة كل المادة الطافية المتبقية بعناية ، والتي تحتوي على بروتين الطعم الخاص بك إلى أنبوب جديد. مرة أخرى ، استخدم جيدا.
قم ببناء نصائح بيبي لإزالة كل المواد الطافية المحتملة. احتفظ بخرز IgG aros للأرنب للتحليل اللاحق. هذه هي العينة الخامسة.
لمنع تلف حبات البكتيريا العقدية ، قم بإزالة الطرف من طرف الأليفة. قم بتعليق الخرزات برفق وإزالة الأليكو إلى أنبوب السيليكون. اغسل البكتيريا العقدية التي تحتوي على حبات مع عازلة S ، مع توضيح الطرد المركزي منخفض السرعة.
بعد كل غسلة. بعد كل غسلة ، قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية. حبات Strept adin صغيرة جدا ويمكن إزاحتها بسهولة حتى عند استخدامها بشكل جيد.
بناء نصائح الأليفة. بعد غسل حبات الدين العقدية. أضف المادة الطافية من تفاعل انقسام TEV إلى هذه الخرزات واحتضن التفاعل لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، باستخدام خلاط دوار.
بعد حضانة جهاز طرد مركزي لديه strept havein الخرز وإزالة sup natum. هذه هي العينة السادسة. من الجدير بالذكر.
يرتبط بروتين بيت الآن بالخرز المتبقي في الأنبوب. اغسل حبات الستربتافيدين التي تحتوي على بروتين الطعم الخاص بك باستخدام محلول التحلل. لإزالة أي بروتينات ملوثة إضافية ، قم بإزالة محلول الغسيل المتبقي من الخرز واتركه على الثلج.
الخطوة السادسة ، شطف البيوتين. في هذه الخطوة ، يضاف البيوتين إلى حبات الستربتافيدين. التفاعل بين البيوتين وخرز الستربتافيدين يحل محل الطعم الذي يعود إلى المحلول.
أضف محلول البيوتين مباشرة إلى الخرزات واقلبها للخلط. احتضان التفاعل عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل باستخدام جهاز طرد مركزي للخلاط الدوار ، خليط البيوتين هواء وجمع الخليط بعناية في أنبوب جديد. هذا هو EIT النهائي الخاص بك المشار إليه باسم العينة السابعة.
الخرز المتبقي العقدي هو عينة ثمانية. نظرا لتركيزه المنخفض للبروتين ، يجب تركيز هذا التحطيف النهائي قبل التحليل. يتم تحقيق ذلك باستخدام الأوزان الجزيئية المنخفضة ، وقطع أعمدة الدوران ، وتقليل الحجم عن طريق مراقبة عملية الطرد المركزي بانتظام.
يمكن تقسيم هذه العينة المركزة وتحليلها على المواد الهلامية لصفحة SDS بواسطة kumasi وصبغة الفضة. إذا كان سيتم تحليل العينات حسب المواصفات الشامل ، فإننا ننصح باستخدام المواد الهلامية التجارية مسبقة الصب. يمكن بعد ذلك استخراج العصابات الفردية وتحديد البروتينات من خلال مواصفات الكتلة.
في هذه الحالة ، كان الطعم هو مورين ، EIF لبروتين E. تتمثل ميزة نظام النقر في أن لديك القدرة على التعبير عن البروتين الذي يثير اهتمامك في خط خلية معين ، واعتمادا على خط الخلية الذي تهتم به ، فإنه يمنحك أيضا القدرة على التعبير عن البروتين بمستويات منخفضة نسبيا. تقرر ذلك ، والاحتفاظ بجميع التعديلات والترجمة بعد الترجمة ، حتى تتمكن في كثير من الأحيان من تنقية المجمع الأصلي.
نظرة عامة
تنقية التقارب الثنائية هي تقنية قوية لتحديد شركائين ارتباط البروتين. تم تطبيق هذه الطريقة على عامل بدء الترجمة eIF4E ل co-ترسيب عوامل الخلية المضيفة المتورطة في بدء الترجمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الفيروسات
- دراسات تفاعل البروتين
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تنقية التقارب الثنائية (TAP) هي طريقة مستخدمة لعزل مجمعات البروتين.
- يتكون علامة TAP من بروتين G وببتيد مرتبط بالستربتافيدين.
- تسمح هذه التقنية بالفصل المحدد لبروتينات الطعم.
- فهم تفاعلات البروتين ضروري لدراسة ديناميكيات الفيروس-المضيف.
غرض الدراسة
- لعزل وتحديد البروتينات التي تتفاعل مع عامل بدء الترجمة eIF4E.
- للتحقيق في التفاعل بين البروتينات الفيروسية والمضيفة أثناء العدوى.
- لإظهار قابلية تطبيق طريقة TAP لمختلف البروتينات.
الطرق المستخدمة
- نقل خلايا HEC 293 مع ناقل تعبير مميز بعلامة TAP.
- انحلال الخلية وتنقية باستخدام IgG الأرنبي وحبوب الستريبتافيدين.
- تفكيك بروتيناز TEV لفصل محدد لبروتينات الطعم.
- عديد من خطوات الغسل والطرد المركزي لضمان نقاء العينات.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح لـ eIF4E وشركائه المتفاعلين.
- تبيان كفاءة طريقة TAP في تحديد مجمعات البروتين.
- تحديد العوامل المحتملة للمضيف المتورطة في بدء الترجمة.
- التحقق من قابلية تطبيق الطريقة لبروتينات أخرى.
الاستنتاجات
- تنقية التقارب الثنائية هي نهج فعال لدراسة تفاعلات البروتين.
- يمكن تطبيق الطريقة على مختلف البروتينات الخلوية والفيروسية.
- فهم هذه التفاعلات يوفر رؤى في التسبب الفيروسي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
