بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تجميع الفيروس داخل الجسم الحي (in vivo) وخارج الجسم الحي (in vitro). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن أحماض RNA لفيروس موزاييك البروم (BMV) في البكتيريا، ثم تعريضها لخلايا نباتية من خلال التسلل الزراعي (agro infiltration). بعد ذلك، يتم تنقية جسيمات BMV الفيروسية من الأوراق التي تم تسللها.

بعد ذلك، يتم تحضير وحدات بروتين القفيصة للتجميع في المختبر. وأخيرًا، يتم تجميع فيروسات BMV Varians في المختبر باستخدام بروتين القفيصة وصبغة الإندوسيانين الخضراء. وفي النهاية، تظهر النتائج تجميع فيروسات bro mosaic varians في المختبر من خلال تكوين أشباح بصرية، والتي يمكن تحديدها عن طريق الامتصاص وانبعاث الفلورسنت.

سنقوم اليوم بعرض تقنية تُعرف بالترشيح (filtration)، وهي تقنية مفيدة لإيصال المكونات الفيروسية إلى النباتات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الاستغناء عن تحضير النسخ المختبرية (in vitro transcripts)، وفي الوقت ذاته، تتيح إيصال مكونات متعددة إلى الخلية ذاتها، مما يسمح بحدوث عدوى متزامنة. والعمل الذي نتابعه حاليًا هو استخدام فيروس موزاييك البروكلي (bro mosaic virus) بالاشتراك مع حامل لون (chromophore) معتمد من إدارة الغذاء والدواء (FDA) وهو السيانين الأخضر (cyanine green)، لتصنيع نوع جديد من الجسيمات النانوية للتطبيقات الطبية الحيوية.

وبالتحديد، نهدف إلى استخدام هذه البنى التي نشير إليها باسم الأشباح السلكية البصرية أو OB gs في أنماط التصوير الضوئي، بما في ذلك التصوير الفلوري والتصوير الضوئي الصوتي، وأيضاً كوسيلة للعلاج بالليزر. ومن التطبيقات السريرية المحددة التي نسعى لتحقيقها حالياً هي استخدام هذه البنى لتصوير سرطان المبيض بالتزامن مع الإجراءات الجراحية. وتكمن الفكرة في أنه يمكننا إضفاء وظائف حيوية على هذه البنى.

إن الـ OBG المزود بزخرفة استهداف محددة يمكنه التعرف على الخلايا الورمية المتبقية، والتي قد تتواجد في حالة سرطان المبيض بشكل خاص داخل التجويف البريتوني. من طبق Agrobacterium مُعد مسبقاً ويحمل RNA لفيروس موز البني (brown mosaic virus) 1 أو 2 أو 3، اختر مستعمرة واحدة لتلقيح 2 mL من وسط LB المحتوي على 50 µg/mL من الكاناميسين و100 µg/mL من الريفامبيسين. قم بتحضين المزرعة لمدة يوم واحد عند 28 °C في هزاز مداري بسرعة 250 RPM. قم بتلقيح 50 mL من وسط LB في دورق إرلنماير سعة 500 mL باستخدام 1 mL من المزرعة، وحضنها لمدة 16 ساعة عند 28 °C في هزاز مداري بسرعة 250 RPM. في اليوم التالي، وعندما تصل المزارع إلى قيمة OD 600 تبلغ 1.0، انقلها إلى أنابيب معقمة سعة 30 mL وقم بطردها مركزياً لمدة 10 دقائق.

قم بإذابة الكريات في 10 milliliters من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar عند سرعة 5,000 RPM ودرجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 5,000 RPM وأربع درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى لضمان الإزالة الكاملة للمضاد الحيوي. بعد ذلك، قم بتعليق الكريات في 10 milliliters من محلول منظم يحتوي على 10 millimolar MES و10 millimolar من كلوريد المغنيسيوم.

قم بقياس الكثافة الضوئية OD 600 لكل مستنبت، ثم اضبطها لتصل إلى OD 600 بقيمة 0.1 باستخدام 10 millimolar من كلوريد المغنيسيوم و 10 millimolar من MES. بعد ذلك، اخلط 10 milliliters من كل معلق من مستنبتات الـ 0.1 OD 600 الثلاثة. أضف الأسيتوفينون ليصل التركيز النهائي إلى 100 millimolar.

اخلط المزيج برفق واتركه دون تحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. وبعد انتهاء فترة الحضن، اسحب المزرعة في سرنجة سعة واحد ملليمتر بدون إبرة. قم بتلقيح معلق المزرعة في الجانب السفلي (الظهري) لورقتين إلى ثلاث أوراق متمددة جيداً من نبات N hamana عن طريق الضغط برفق بالسرنجة على نصف السطح السفلي لكل ورقة.

احتفظ بالنباتات الملقحة في الدفيئة الزراعية عند 24 درجة Celsius لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام قبل حصاد الأوراق. بعد تنقية فيريونات BMV، قم بتحضير لتر واحد من محلول تفكيك الفيروس بتركيز 1x. بعد ذلك، قم بتجهيز غشاء الدياليز.

وفقاً لطريقة sambrook وآخرين، يتم توزيع من 5 إلى 10 mg/mL من الفيروس المُنقى داخل كيس دياليز، ثم يُوضع الكيس في دورق يحتوي على virus dissociation buffer بتركيز 1x. يتم إجراء الدياليز للفيروس لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 4 °C مع التحريك.

اجمع المحلول من كيس الديلزة ثم قم بطرده مركزياً بسرعة 30,000 RPM لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C لترسيب أي جزيئات فيروسية غير مرتبطة. قم بطرد السائل العلوي مركزياً بسرعة 30,000 RPM لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C. بعد تحضير نسخ RNA لإعادة تجميعها في جسيمات فيروسية، اخلط وحدات بروتين القفيصة مع نسخ RNA بنسبة واحد إلى خمسة.

قم بتوزيع الخليط في كيس دياليز وأحكم إغلاقه جيداً لتجنب أي تسريبات. بعد تحضير لتر واحد من محلول RNA assembly buffer بتركيز 1X، قم بإجراء الديلزة لخليط تفاعل إعادة التجميع في هذا المحلول عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، أخرج الخليط من كيس الدياليز وأضف 1.5 milliliters من RNA assembly buffer، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة 30,000 RPM لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، تخلص من supernatant وأعد تعليق pellet.

بعد ذلك، قم بتقدير تركيز الفيريونات عند كثافة ضوئية OD 260 نانومتر. ثم حدد تركيز وحدات بروتين القفيصة الفرعية عند كثافة ضوئية OD 280 نانومتر أو باستخدام طرق أخرى مثل مقايسة برادفورد (Bradford Assay) لتحديد سلامة وحدات بروتين القفيصة المفككة. قم بإجراء فصل كهربائي للهلام (SDS page) بنسبة 12 إلى 15% متبوعاً بنقل البروتين (western blotting). وأخيراً، اتبع الإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب لإنتاج الأشباح الفيروسية البصرية (optical viral ghosts) أو ov cheese.

تظهر هنا صورة مجهرية إلكترونية نافذة لجسيمات BMV Varion المصبوغة صبغاً سلبياً والمنقاة من نباتات end hamana التي تم حقنها زراعياً بمزيج من جميع بنى BMV agri من النوع البري. تُظهر صورة TEM هذه أشباحاً فيروسية بصرية تحتوي على صبغة الإندوسيانين الخضراء ومصبوغة صبغاً سلبياً. وهنا، يتم عرض أطياف الامتصاص والفلورة للأشباح الفيروسية البصرية بمجرد إتقانها.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس دقائق لكل عينة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تغليف المكونات الفيروسية أو غير الفيروسية داخل وحدات بروتين القفيصة الفرعية.