نظام الحرير ثقافة السينما ل في المختبر تحليل وتصميم مادة بيولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد فيلم حريري في نظام الثقافة المختبرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج محلول الحرير أولا لصنع الفيلم المطلوب. الخطوة الثانية هي صب محلول الحرير على سطح صب مطاط السيليكون والسماح للفيلم بالجفاف.

تتم معالجة الفيلم الحريري لاحقا لزراعة الخلايا. بعد ذلك ، يتم تجميع نظام الثقافة باستخدام تقنية معقمة. الخطوة الأخيرة هي بذر الأغشية الحريرية بنوع الخلية المطلوب.

في النهاية ، يمكن تصوير أسطح ثقافة فيلم الحرير أو فحصها مباشرة داخل الثقافة. يمكن إزالة الألواح أو العينات للتثبيت والمعالجة الإضافية حسب الحاجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الاستزراع على بلاستيك زراعة الأنسجة القياسي ، هي أن المواد الحيوية لغشاء الحرير متوافقة حيويا للغاية ويمكن للباحثين نقلها بسهولة إلى تطبيقات المصب في الجسم الحي وفي المختبر.

يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات بيولوجيا الخلية والمواد الحيوية ، مثل كيف يمكن استخدام تضاريس السطح للتأثير على استجابة الخلية؟ على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للاستجابة الظهارية للقرنية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى حيث يمكن أن توفر التجارب الأولية في المختبر إجابات أولية لأنظمة أكثر تعقيدا في الجسم الحي. لبدء تصنيع قوالب مطاط السيليكون ، احصل على السطح الطبوغرافي المطلوب للصب لهذا العرض التوضيحي.

يتم استخدام رقاقة سيليكون محفورة قياسية مقاس 100 ملم. PDMS بوتينغ ومحلول محفز بنسبة تسعة إلى واحد ، كما هو موضح من مجموعة تم شراؤها. امزج المحاليل جيدا لبدء عملية المعالجة.

بعد وضع سطح رقاقة السيليكون داخل طبق الصب ، قم بوزن 4.5 جرام من محلول PDMS على رقاقة السيليكون. بعد أن ينتشر محلول PDMS على الرقاقة بالتساوي ، قم بتغطية الرقاقة بغطاء طبق بتري بقطر 100 ملم وضعه عند 10 ملليمترات من الزئبق لمدة ساعتين. لإزالة فقاعات الهواء من محلول PDMS ، ضع إعداد الصب على سطح مستو في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي ، ضع رقاقة السيليكون PDMS المعالجة في حمام الإيثانول بنسبة 100٪.

قبل إزالة PDMS ، ابدأ في إزالة PDMS من الرقاقة باستخدام شفرة حلاقة لرفع حافة المحيط باستخدام ملقط اسحب PDMS برفق داخل حمام الإيثانول بنسبة 100٪. مع الحرص على عدم تمزيق صب مطاط السيليكون ، قم بتثقيب قوالب PDMS الفردية باستخدام ثقب 14 ملم. تم تصميم هذا القطر ليناسب آبار صفيحة 24 بئر.

لتحضير محلول الحرير ، احضر لترين من الماء المقطر ليغلي. في مكبر صوت زجاجي ، قم بتقطيع خمسة جرامات من شرانق دودة القز الماوري بومبكس إلى أثلاث ، وتخلص من الشرانق الملوثة على نطاق واسع كما يتضح من جزيئات الحشرات المفرطة التي تغطي سطح الشرنقة الداخلي. أضف 4.24 جرام من كربونات الصوديوم ببطء إلى حجم الماء المغلي لمنع الغليان.

بمجرد ذوبان كربونات الصوديوم ، أضيفي قطع الشرنقة إلى الماء المغلي وقلبي باستخدام لوح تقليب مطلي بالتفلون لمدة 40 دقيقة. بعد الغليان ، قم بتصريف الماء المقطر بحذر في الحوض واعصر مستخلص الحرير يدويا لإزالة الماء الزائد. ثم اغسل مستخلص الحرير بوضعه في دورق بلاستيكي مع لتر واحد من الماء المقطر مع التقليب لمدة 20 دقيقة.

كرر عملية الغسيل هذه بالماء العذب مرتين. قم بتدوير مستخلص الحرير المغسول يدويا وضع مستخلص ألياف الحرير داخل غطاء كيميائي للسماح بالتجفيف لمدة 12 ساعة. في اليوم التالي ، قم بوزن ألياف الحرير المجففة ، والتي عادة ما تكون حوالي 3.5 جرام.

ثم قم بإعداد محلول بروميد الليثيوم 9.3 مولار لمحلول من الحرير بنسبة 20٪ من الوزن إلى الحجم وفقا للبروتوكول المكتوب. بعد وضع مستخلص الحرير في الدرق. صب محلول بروميد الليثيوم فوق ألياف الحرير.

تأكد من غمر ألياف الحرير داخل المحلول. باستخدام ملعقة معمل ، ثم ضع الحرير المذاب في فرن 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات ، استخدم حقنة بحجم مناسب لسحب 12 مل من محلول الحرير.

بعد وضع إبرة قياس 18. في نهاية المحقنة ، قم بحقن المحلول في شريط غسيل الكلى. بعد ملء الكاسيت ، اسحب الهواء المتبقي من الكاسيت باستخدام المحقنة المفرغة.

ضع علبة غسيل الكلى المملوءة في لتر واحد من الماء المقطر. قم بتغيير الماء بعد ساعة واحدة وأربع ساعات وثماني ساعات ثم ثلاث مرات كل 12 ساعة ليصبح المجموع ستة تغييرات. بعد غسيل الكلى.

اجمع محلول الحرير ببطء من الكاسيت باستخدام المحقنة وانقله إلى أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي المحلول عند 10 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة بعد الطرد المركزي. ضع سوبر ناتين في أنبوب جديد.

بعد تكرار هذه العملية مرة ثانية، ضع عينتين من محلول الحرير سعة 0.5 مل في أطباق مصل اللبن الصغيرة المنفصلة. ضع أطباق مصل اللبن داخل فرن جاف بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة أو حتى يعمل محلول الحرير. يمكن تخزين محلول الحرير السائب عند أربع درجات مئوية.

قم بوزن غشاء الحرير الصلب المتبقي من كلتا العينتين لقياس كثافة تركيز بروتين الحرير في المحلول. قم بإعداد أسطح صب PDMS باستخدام شريط شفاف لإزالة أي غبار. بعد ذلك ، قم بتنظيف ركائز PDMS عن طريق نقعها في 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بإزالتها واتركها حتى تجف. لإنتاج فيلم بسمك 50 ميكرومتر ، انشر 70 ميكرولترا من محلول الحرير بنسبة 8٪ على قوالب PDMS. باستخدام أداة نشر السائل مثل طرف حقنة سعة مليلتر واحد ، اسمح للأغشية الحريرية بالجفاف مكشوفة على مقعد نظيف للتدفق الرقائقي عن طريق تشغيل ضغط تدفق هواء يبلغ 150 باسكال لمدة 90 دقيقة أو حتى تجف الأغشية.

بمجرد أن تجف الأفلام ، ضع مجموعة الأفلام بأكملها بما في ذلك قوالب PDMS في غرفة الماء والركوع لأكثر من أربع ساعات لإنتاج فيلم غير قابل للذوبان في الماء. عادة ما تكون هذه غرفة فارغة مجففة بها ماء في قاع الحوض ، يتم سحبها عند فراغ 25 كيلو باسكال بعد إزالة أغشية الحرير من الماء وغرفة الركوع. اعمل على مقعد نظيف للتدفق الصفحي لإعداد حمام إيثانول بنسبة 70٪ في طبق بتري 35 ملم.

ثم ضع أي ركائز تحكم وحلقات من الفولاذ المقاوم للصدأ في الطبق لمدة 10 دقائق على الأقل من أجل تعقيمها. بعد ذلك ، قم بإزالة الأغشية الحريرية من قوالب PDMS باستخدام الملقط. اغمسها في 70٪ من الإيثانول وضع كل فيلم في بئر واحد من 24 لوحة بئر مملوءة مسبقا بمليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول.

تأكد من أن جانب النمط متجها لأعلى للسماح بالتصاق الخلية لضمان النجاح في هذه الخطوة ، من المهم وضع الأغشية الحريرية بشكل صحيح ومعقم داخل الآبار ضع حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ فوق أفلام SLT واتركها تحتضن لمدة 10 دقائق بعد عينة غسل الفيلم كما هو موضح في النص ، قم بإعداد خط الخلية للجلوس حسب التوجيهات هناك. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام خط الخلايا الظهارية القرنية الحزوية البشرية كخطوة أخيرة عينة 500 ميكرولتر من تعليق HCLE لكل بئر ، وعادة ما تستخدم كثافة 10 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع والمضي قدما في تشغيل البروتوكول التجريبي المطلوب. تظهر هنا صور مجهرية إلكترونية لخط خلايا HCLE ، تلتصق بأغشية الحرير المزخرفة والمسطحة في اليوم الثاني.

في ثقافة HCLE ، تستمر الثقافات في التكاثر لتلتقي على الأسطح المزخرفة والمسطحة بحلول اليوم الثامن. في الثقافة هنا ، زراعة أغشية الحرير المزخرفة والمسطحة ، تتم مقارنة خلايا HCLE بركائز التحكم في الزجاج في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم الثامن. في القياس الكمي للثقافة مع محتوى الحمض النووي SQU وبيانات فحص النشاط الأيضي MTT تظهر قابلية HCLE على كل من ركائز الأغشية الحريرية المزخرفة والمسطحة عند مقارنتها بأسطح التحكم في الزجاج بمرور الوقت.

يظهر هنا تصوير تباين المرحلة المتتابعة لخلايا HCLE التي تهاجر فوق سطح فيلم حريري منقوش. خلال فترة زمنية مدتها 18 ساعة ، تم وضع الخلايا بكثافة 10 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع وتم زراعتها لمدة ساعتين قبل التصوير للمقارنة لتصوير التباين في مرحلة الفاصل الزمني لخلايا HCLE التي تهاجر فوق سطح تحكم مستو خلال فترة زمنية مدتها 18 ساعة في ظل نفس ظروف الاستزراع. بمجرد تحضير محلول الحرير وقولبة السيليكون ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح باتباع هذا الإجراء.

يمكن تقييم طرق أخرى مثل المسح المناعي الفلوري والمجهر الإلكتروني وتقنيات البيولوجيا الجزيئية مثل البقع الغربية والمقايسات المناعية جنبا إلى جنب مع المقايسات الكيميائية مثل بقاء الخلية وتكاثر الخلايا ومعدل الأيض لفهم استجابة الخلية بشكل أفضل على خدمات التصميم المخصصة المختلفة هذه. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع محلول الحرير ، وإنشاء نمط مخصص ، وأفلام حريرية وثقافة. أي نوع خلية على هذه الركائز.