Name: الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: اكتشف أنماط التفرع المحوري لخلايا DRG في الحبل الشوكي الجنيني للفأر باستخدام تحضير الجبل الكامل. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تطور الأعصاب وآليات التفرع العصبي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أود أن أشكر الدكتور أليستير Garratt (دلبروك مركز برلين) للحصول على تعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل مركز البحوث التعاونية (SFB665) التابع لمجلس البحوث الألمانية (DFG).

1. التشريح الداخلي ملاحظة : استخدام التجريبي من الفئران يجب أن تتبع مبادئ توجيهية وافق رسميا لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التحضير وإعداد مجهر تشريح الخاص ووضع الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح بما مقص الكبيرة والصغيرة ، ملقط مسنن كبيرة ، ملقط المنحنية وأربع مجموعات من No.5 دومون تشريح ملقط (اثنان منها داخل مصقول نصائح) ( لمزيد من التفاصيل انظر جدول الكواشف محددة والمعدات). وضع ورقة تصفية في طبق بيتري 100 ملم Sylgard المغلفة. صب الباردة PBS في الآبار لوحة 12 - جيدا ، وطبق بتري 100 ملم وأنبوب 12 مل وترك على الجليد. ماصة 2ml العازلة من التثبيت (بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4) في كل جانب من لوحة ال 12 ثانية وكذلك مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخدير والتضحية السد حامل في توقيت E12.5 (عين الكشف عن المكونات المهبلية كما E0.5) ، ضع الماوسمع ما يصل به الجانب البطنية على ثلاث ورقات من المناشف الورقية ، ونقع في منطقة البطن مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف بطني حوضي ، عزل قرون الثنائية الرحم وتحويلها الى واحدة من الأطباق 100 ملم مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت رقابة مجهرية ، وجعل شق طولي لجدار الرحم مع مقص ، وقطع صغيرة على التوالي بعيدا كل كيس من المشيمة الذي يحيط بالجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا الكيس السلوي من كل جنين وقطع الحبل السري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص صغير ، تقضي على الأجنة ووضع رؤساء أو جزء منها جانبا لعزل الحمض النووي الجيني إذا كان يجب أن تكون هناك حاجة التنميط الجيني. بعد ذلك ، نقل إلى torsi آبار منها في لوحة ال 12 جيدا مع PBS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب ورقة الترشيح في صحن Sylgard مع بضع قطرات من برنامج تلفزيوني والجذع الجنينية ظل وضع مع الجانب الظهري حتى على الورق. من أجل تحسين الاستقرار ، وتصويب ذيله والأطراف بعيدا عن الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عاملتحت المجهر تشريح مع التكبير من 16X تقريبا ، قرصة بعناية جلد الجنين فوق الحبل الشوكي مع اثنين من أزواج من الغرامة ويميل ملقط المسيل للدموع وبصرف النظر برفق. بداية في الوسط ، والمضي قدما أولى نحو الذيل ومن ثم استئناف من الوسط باتجاه الجانب الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الجنين من وقت لآخر مع اثنين أو ثلاث قطرات من برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وteared لمنع ذلك DRG الخروج من النخاع الشوكي عند إزالته من الجنين فصل DRG والنخاع الشوكي من العمود الفقري الغضروفية المحيطة الحركات الأفقية التي تنزلق مع شفرة لملقط مع غرامة داخل مصقول النصائح. تبدأ في منتصف الجانب الأيمن للجنين ، والعمل طريقك نحو الذيل ثم إلى نهاية الأمامي. بعد ذلك ، كرر العملية على الجانب الآخر. يجب الحرص على عدم مزق قبالة DRG المرتبطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل تماما الحبل الشوكي خففت من الجنين ، والتقاط العنق والخمسينآل جزء مع ملقط الجميلة وتخلعها في قطعة واحدة نحو نهايته الذيلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغرق الحبل الشوكي معزولة مع DRG تعلق في بئر من لوحة ال 12 مليئة جيدا العازلة التثبيت والمضي قدما في إعداد النخاع الشوكي من الأجنة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الحبل الشوكي ما لا يقل عن ساعتين على الجليد. </li></ol> 2. الجاذبة وضع العلامات من الخلايا العصبية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الحبل الشوكي التي يتم وسمها ، وإعداد الإبر الزجاج اثنين مع مجتذب micropipette. نحن نستخدم نموذج سوتر مجتذب P - 97 مسرى (إعداد البرنامج : 1 HEAT = 625 ، فيل = 35 ، TIME = 175 ؛ HEAT 2 = 600 ، فيل = 25 ، TIME = 175 ؛ 3 HEAT = 630 ، فيل =... 30 ، الوقت = 150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت رقابة مجهرية تراجع غيض من كل إبرة الزجاج 3-5 مرات في الحل (ث / ت) 5 ٪ من الجاذبة في الإيثانول. تبخر الإيثانول يخلق طبقة رقيقة من بلورات الجاذبة على الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعمل تحت مجهر تشريح مع التكبير من 40X تقريبا ، وضع الحبل الشوكي مع v لهاentral الجانب حتى على شريحة. باستخدام مقص الربيع ، وفتح الحبل على الجانب البطنية على طوله كله من خلال قطع floorplate لتسمح في وقت لاحق من تزايد اعداد في وضع مقلوب كتاب مفتوح (انظر الفرع جيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف النخاع الشوكي مع الجانب الظهري حتى على شريحة. ثم سلك نهج يدويا مع طرف الجاذبة مغطاة من الزجاج تحت التصور إبرة مجهرية وبعناية يخترق كل DRG الثاني على أحد جانبي الحبل الشوكي. وينبغي أن ما يقرب من أي آثار للالجاذبة تكون مرئية في DRG مثقوبة لضمان وضع العلامات على عدد صغير فقط من الخلايا العصبية. أخذ إبرة الثاني لفي الجانب الآخر من السلك. تهدف فقط كل DRG second يتجنب تداخل إسقاطات محواري المسمى من DRG المجاورة التي قد تعقد في التفريق بين محاور فردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الحبل الشوكي إلى المخزن المؤقت التثبيت واحتضان في الظلام لمدة ست ساعات على الأقل عند درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لإعطاء الوقت للصبغة لديffuse على طول المحور العصبي داخل غشاء البلازما. السماح لفترة أطول الحضانة (ما يصل الى يومين في 4 درجات مئوية) وإذا كان المطلوب تحليل النمو الجانبية في الحبل الشوكي. </li></ol> 3. التركيب والتحليل المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد صبغ الموقف ، ونشر الحبل الشوكي واحد مع الجانب الظهري أسفل على ساترة في قطرة من برنامج تلفزيوني. تعتني أن DRG المرفقة الموجهة بشكل صحيح وأفقيا لا تختلط لا. نضح السوائل الزائدة وتتسطح بها الحبل في وضع مقلوب كتاب مفتوح باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل التحضير على شريحة المجهر باستخدام برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لمنع زيادة غير مرغوب فيها تحليل الخلفية تلطيخ المجهري مضان من الإسقاطات محواري المسمى ستنفذ يوم المتزايدة. حتى تبقي ثم الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. ممثل النتائج : الحبل الشوكي من الفأرة يستقبل الأسبوعية واردojections من 8 أزواج من عنق الرحم ، و 13 زوجا من الصدر ، و 5 أزواج من أزواج القطنية والعجزية DRG 4 من مجموعها إلى 60 العقد الشوكي. ويمكن بعد بعض التدريب يمكن عزل الحبل الشوكي مع معظم DRG لا تزال تعلق من جنين في أقل من خمس دقائق. يناسب هذا الإجراء لعزل النخاع الشوكي مع DRG المرفق من E11.5 لأجنة الفئران E13.5. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل النتائج من E12.5. وتظهر النتائج المثالية لإجراء التوسيم وصفها هنا في الشكل 3. ثم قد وسم DRG على طول الحبل الشوكي يمكن استخدامها لتحديد المحاور المتفرعة السلوك على مستويات مختلفة الفقري (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط تصور وضعي الرئيسية المتفرعة من المحاور. (أ) المتفرعة من أنشطة مخروط النمو الذي يمكن أن يؤدي إلى التشعب -- كما هو مبين هنا -- فضلا عن العرش محطة معقدة أو(ب) تشكيل الجانبي في العمود محوار (الخلالي المتفرعة). الوضع الأخير هو نوع من الهيمنة المتفرعة إسقاط المحاوير القشرية والمهادي 6،7. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> الشكل 2 إسقاطات وارد من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية عرض كلا النوعين من المتفرعة المحاور : المحاور أول فرع في DREZ بواسطة التشعب (1) وشكل من ابنة الناتجة الضمانات فروع بعد فترة الانتظار التي المتفرعة الخلالي (2). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> الشكل 3. التصور مسارات محواري واحدة من الخلايا العصبية الجنينية DRG الماوس. (أ) مع الحبل الشوكي DRG المرفقة أعدت من جنين فأر E12.5. وترد (شريط المقياس ، 1 ملم.) دينار بحريني () آراء الظهرية من الجاذبة المسمى DRG البرية من نوع الفئران في زيادة التكبير. باء في كل DRG الثاني هو labeleد بواسطة الجاذبة. هي مقلوب الصور مضان ، عجزي هو في اليسار وجيم ودال ، الوحشي هو في القاع. C هو المسمى في عدد صغير من المحاور وعلى أعلى التكبير ويمكن تحديد وجود مثل T - فروع في DREZ من الحبل الشوكي. (أشرطة مقياس ، 250 ميكرون (B) ، و 100 ميكرومتر (C) و 50 ميكرون (D)). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> الشكل 4. الكمي لشكل T والفروع ، واحد يتحول منقاري أو الذيلية في نوع البرية ونوع C - الناتريوتريك الببتيد (CNP) الفئران التي تعاني من نقص في E13.5. ونظرا لعدد واحد يحسب المحاوير بين قوسين لمستويات مختلفة لكل الجذع الوراثي. C - R - أو يتحول -- النمو فقط في اتجاه والذيلية أو منقاري ، على التوالي. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> الشكل 5. مسار المركب والإشارات الحسية مشغلات محوار التشعب في DREZ من الحبل الشوكي. (أ) من نظاميشير المسار المركب يتكون من CNP يجند ، ومستقبلات غوانيليل Npr2 محلقة وسيرين / ثريونين cGKIα كيناز DRG في الخلايا العصبية الجنينية. Npr2 يولد المركب من GTP على التحفيز التي CNP. (ب) الجاذبة تتبع واحدة من محاور الخلايا العصبية في الفئران DRG من النوع البري وCNP ناقصة. (شريط قياس ، 25 ميكرون).

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
<li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li>
<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
<li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding%3A+implications+for+target+recognition+and+%26quot%3Bwaiting+periods%26quot%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &quot;waiting periods&quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li>
<li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li>
<li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+%28CNP%29+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li>
<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

أنماط الإسقاط النمطية التي تضم كلا النوعين من تشكيل فرع محواري مع سهولة التحضير في تركيبة مع استخدام الأنسجة الثابتة لوصفها الجاذبة يجعل الحبل الشوكي الجنينية المرفقة مع نموذج DRG مواتية لدراسة المحاور المتفرعة. تطبيق كميات ضئيلة من الجاذبة باستخدام الإبر الزجاج المطلي يسمح -- على النقيض من معظم العلامات DRG -- التصور مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية وبالتالي DRG تحليل المحاور الفردية وأنماطها المتفرعة. ويمكن وصف طريقة تحسينها عن طريق الحقن iontophoretic من التتبع محبة للدهون مما ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope Stemi جمهورية الكونغو الديمقراطية </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة الحل (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> ميرك </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> مقص جراحي القياسية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> معيار ملقط مسنن </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> غرامة اضافية مقص القزحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> منحني ملقط </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> دومون No.5 غرامة ملقط نصائح </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> دومون No.5 مرآة الانتهاء ملقط </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas - توبنغن ربيع مقص </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> ورق الترشيح </td><td> فيشر العلمية </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> آلات العالم Precission </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 ملم أطباق بتري </td><td> غرينر </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 مل أنبوب البولي بروبلين </td><td> كارل روث محدودة </td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 لوحة جيدا ثقافة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> ميرك </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> المشتعلة / براون micropipette مجتذب P - 97 </td><td> شركة سوتر الصك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> صلاح الغيدان (1،1 &#39;- Dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - ميثيل -- indocarbocyanine البركلورات) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر الشرائح SuperFrost بلس </td><td> كارل روث محدودة </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> زلات تغطية الزجاج </td><td> كارل روث محدودة </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

الجاذبة - drg وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

هنا نقدم تقنية لتسمية المسارات من مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية التي تلطيخ ناشر باستخدام التتبع محبة للدهون 1،1 &#39;- dioctadecyl - 3 ، 3،3&#39; ، 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine بيركلورات (الجاذبة) 1 . المقارنة بين مسارات محواري من نوع تلك البرية مع خطوط الماوس في تحور الجينات التي تسمح للاختبار لدور وظيفي للبروتينات مرشح في السيطرة على المحاور المتفرعة وهو آلية أساسية في الأسلاك في الجهاز العصبي. المتفرعة محواري تمكن خلية عصبية الفردية للتواصل مع أهداف متعددة ، وبالتالي توفير الأساس المادي للالمعالجة المتوازية للمعلومات. ويمكن التمييز بين تشعبات في المناطق المستهدفة وسيطة من النمو محواري تشجر من المحطة. وعلاوة على ذلك ، يمكن تصنيف أنماط مختلفة من تشكيل فرع محواري اعتمادا على ما إذا كانت النتائج المتفرعة من أنشطة مخروط النمو (تقسيم أو تأخر الصدريةدعا nching) أو من الناشئين للضمانات من رمح محوار في عملية المتفرعة خلالي 2 (الشكل 1). وسط توقعات من الخلايا العصبية من DRG تقترح نظام التجريبية مفيدة لدراسة كلا النوعين من المحاور المتفرعة : عندما تصل إلى المحاور الخاصة بهم وارد دخول منطقة الجذر الظهري (DREZ) من النخاع الشوكي بين الجنينية أيام 10-13 (E10 -- E13) أنها عرض نمط من نمطي T - Y أو التشعب الشكل. وهما ابنة المحاوير الناتجة ثم المضي قدما في اتجاهات منقاري أو الذيلية ، على التوالي ، على هامش ظهراني من الحبل ، وفقط بعد فترة انتظار الضمانات برعم من هذه المحاور العصبية الجذعية لتخترق المادة الرمادية (المتفرعة خلالي) ومشروع لخلايا عصبية معينة في التتابع صفيحة من الحبل الشوكي حيث arborize أخرى (محطة المتفرعة) 3. وقد كشفت اقتفاء الجاذبة مخاريط النمو في منطقة الجذر الظهري دخول من الحبل الشوكي التي على ما يبدو في العلاقات العامةويتسبب ocess تقسيم مما يوحي بأن التشعب من خلال تقسيم للمخروط النمو ذاته 4 (الشكل 2) ، ومع ذلك ، فقد تمت مناقشة خيارات أخرى ك 5 أيضا. هذا الفيديو يوضح أولا كيف لتشريح النخاع الشوكي للفئران E12.5 ترك DRG المرفقة. يتم تطبيق التثبيت التالية من كميات صغيرة من عينات الجاذبة للDRG باستخدام الإبر الزجاج سحبها من الانابيب الشعرية. بعد خطوة الحضانة ، هي التي شنت على الحبل الشوكي المسمى باعتباره إعداد كتاب مفتوح مقلوب لتحليل المحاور الفردية باستخدام المجهر مضان.

التوقعات النمطية للafferents الحسية في الحبل الشوكي القوارض توفر نظام يمكن الوصول إليها بسهولة تجريبية لدراسة المحاور المتفرعة من خلال تتبع محاور واحد.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

نقدم هنا تقنية لوسم مسارات مجموعات صغيرة من عصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) داخل الحبل الشوكي الجنيني عن طريق الصبغ الانتشاري باستخدام...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أنماط تفرع المحاور العصبية الفردية لعصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) في تحضير كامل للتركيب (whole mount) للنخاع الشوكي لجنين الفأر. ومن أجل تحديد الجزيئات المشاركة في التفرع المحوري، توفر بروزات عصبونات DRG في النخاع الشوكي للفأر نظاماً تجريبياً بسيطاً وسهلاً ومتاحاً لدراسة التفرع المحوري. وعندما تصل المحاور العصبية (ENT) لعصبونات DRG إلى منطقة دخول الجذر الظهري للنخاع الشوكي، فإنها تظهر نمطاً نمطياً من التشعب على شكل T أو Y.ثم تمتد المحوران الناتجان في اتجاهين منقاري أو حبلي، على التوالي، عند الحافة الجانبية الظهرية للحبل الشوكي. وبعد فترة انتظار فقط، تنبثق براعم جانبية من هذه المحاور الجذعية لتخترق المادة الرمادية وتتصل بعصبونات ترحيلية في صفائح محددة من الحبل الشوكي حيث يحدث التشجر الطرفي. يوضح هذا الفيديو أولاً كيفية تشريح الحبل الشوكي.بعد تثبيت العينة، يتم وضع كميات دقيقة من dii على العقد الجذرية الظهرية (DRG) المرتبطة بجنين فأر في اليوم الجنيني 12.5، وذلك باستخدام إبر زجاجية مسحوبة من أنابيب شعرية. وبعد خطوة التحضين، يتم تثبيت الحبل الشوكي المسمى كتحضير "كتاب مفتوح مقلوب" لتحليل المحاور العصبية الفردية باستخدام المجهر الفلوري. يعد تفرع المحاور العصبية جانباً هاماً في تطور الاتصال العصبي. وتسمح الطريقة المعروضة هنا بمقارنة أنماط التفرع من النوع Y مع تلك الموجودة في الفئران الطافرة، مما يتيح تحديد الجزيئات التي تنظم تفرع المحاور العصبية.أولاً، قم بتجهيز مجهر التشريح ورتب الأدوات الجراحية اللازمة لعملية التشريح. ضع ورقة من ورق الترشيح في طبق بتري بقطر 100 millimeter ومطلي بمادة silk guard. بعد ذلك، صب محلول PBS البارد في آبار صفيحة ذات 12 بئراً، وفي طبق بتري بقطر 100 millimeter، وفي أنبوب سعة 12 milliliter، واتركها على الثلج.باستخدام الماصة، ضع 2 mL من محلول تثبيت البارالدهيد بتركيز 4% في كل بئر من طبق ثانٍ يحتوي على 12 بئراً، ثم ضعه على الثلج. بعد عزل القرون الرحمية الثنائية من الفأر، انقلها إلى طبق قطر 100 mm يحتوي على PBS بارد جداً. بعد قطع رؤوس الأجنة، انقل الـ toci الخاصة بالأجنة إلى الطبق ذي الـ 12 بئراً.بلل ورق الترشيح الموجود في طبق S guard ببضع قطرات من PBS، ثم ضع جذع الجنين بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى على الورق لضمان ثبات أفضل. قم بفرد الذيل والأطراف بعيداً عن الجسم أثناء العمل تحت مجهر تشريحي بتكبير يبلغ 16 مرة تقريباً. أمسك جلد الجنين بعناية فوق الحبل الشوكي باستخدام زوجين من الملاقط دقيقة الرأس، بدءاً من المنتصف.قم بتمزيق الجلد برفق أولاً باتجاه الذيل، ثم استأنف من المنتصف باتجاه الجانب الأمامي. بلل الجنين من وقت لآخر بنقطتين أو ثلاث نقاط من PBS لمنعه من الجفاف ولضمان عدم تمزق عقد الجذر الظهري أو DRG من الحبل الشوكي. عند إزالته، افصل DRG والحبل الشوكي عن العمود الفقري الغضروفي المحيط به، وذلك بالبدء من منتصف الجانب الأيمن للجنين والعمل باتجاه الذيل، ثم باتجاه الطرف الأمامي لفصل الحبل الشوكي الذي تم إرخاؤه تماماً عن الجنين.استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بالجزء العنقي واسحبه قطعة واحدة باتجاه الحبل الشوكي. في النهاية، اغمر الحبل الشوكي المعزول مع العقد الجذرية الظهرية (DRG) الملحقة به في إحدى فتحات لوحة ذات 12 فتحة مملوءة بمحلول التثبيت، ثم تابع تحضير الحبال الشوكية من بقية الأجنة.قم بتثبيت الحبال الشوكية لمدة ساعتين على الأقل على الثلج لكل حبل سيتم وضع علامة عليه، وجهز إبرتين زجاجيتين باستخدام ساحب الماصات الدقيقة تحت تحكم مجهري. اغمس طرف كل إبرة زجاجية من ثلاث إلى خمس مرات في محلول صبغة بنسبة 5% في الإيثانول لتكوين طبقة رقيقة من بلورات الصبغة على الإبرة، وذلك أثناء العمل تحت مجهر تشريحي بتكبير يبلغ 40 مرة تقريبًا. ضع حبلاً شوكيًا على شريحة بحيث يكون جانبه البطني للأعلى باستخدام مقصات زنبركية.افتح الحبل الشوكي على الجانب البطني على طوله بالكامل عن طريق القطع عبر الصفيحة الأرضية للسماح بالتثبيت المفتوح المقلوب. ضع الحبل الشوكي بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى على الشريحة. بعد ذلك، اقترب يدويًا من الحبل الشوكي باستخدام طرف الإبرة الزجاجية المغطى بـ dai واثقب بعناية كل عقدة جذر ظهرية (DRG) ثانية على أحد جانبي الحبل الشوكي.يجب ألا تظهر أي آثار تقريباً من صبغة dai في العقد الجذرية الظهرية (DRG) التي تم ثقبها، وذلك لضمان وسم عدد صغير فقط من العصبونات باستخدام الإبرة الثانية. كرر العملية للجانب الآخر من الحبل الشوكي، مع استهداف كل عقدة جذرية ظهرية (DRG) ثانية فقط، لتجنب تداخل الإسقاطات المحورية الموُسمة من العقد المجاورة، الأمر الذي قد يصعب عملية التمييز بين المحاور العصبية الفردية.أَعِد الحبل الشوكي إلى محلول التثبيت واتركه في الظلام لمدة ست ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C لإعطاء وقت كافٍ لانتشار الصبغة على طول المحور العصبي داخل الغشاء البلازمي. بعد انتشار الصبغة، ضع حبلاً شوكياً واحداً بحيث يكون جانبه الظهري لأسفل على غطاء شريحة في قطرة من PBS، ثم اسحب السوائل الزائدة، وبسط الحبل الشوكي بنمط الكتاب المفتوح المقلوب باستخدام الملقط.تأكد من توجيه العقد الجذرية الظهرية (DRG) المرفقة جانبياً بشكل صحيح وعدم تداخلها، ثم قم بتثبيت العينة على شريحة مجهرية باستخدام PBS لمنع زيادة التصبيغ الخلفي غير المرغوب فيه. يجب إجراء تحليل المجهر الفلوري للإسقاطات المحورية المحددة في يوم التثبيت. وحتى ذلك الحين، تُحفظ الشرائح في الظلام عند درجة حرارة 4 °C.تظهر هنا مناظر ظهرية لـ DRG الموسومة بـ Dai من فئران من النوع البري بتكبيرات متزايدة كما هو موضح في كل ثانية. لقد تم وسم DRG بواسطة Dai. وهنا، تظهر مجموعة صغيرة من المحاور العصبية موسومة، وعند تكبير أعلى، يمكن تحديد وجود تفرعات تشبه حرف T في منطقة دخول الجذر الظهري للنخاع الشوكي.الفروع على شكل حرف T. يتم هنا قياس عدد المنعطفات المنقارية R أو الحبلية C المفردة عند مستويات فقارية مختلفة في كل من الفئران من النوع البري والفئران التي تعاني من نقص الببتيد المدر للصوديوم من النوع C (CMP). في المرحلة E 13.5.يظهر العدد الإجمالي للخلايا العصبية التي تم عدّها بين قوسين، وتظهر نسبة نوع المسار أدناه. وعلى النقيض من المحاور العصبية للنوع البري في عصبونات DRG، فإن المحاور في طفرات إشارات CMP تنعطف في اتجاه واحد فقط بدلاً من التشعب عند منطقة دخول الجذر الظهري للنخاع الشوكي. وقد ساعدتنا هذه الطريقة في تحديد شلال إشارات CGP الذي يعد ضرورياً لتشعب المحاور الحسية عند منطقة دخول الجذر الظهري.على عكس الأنماط البرية من cgm، فإن حركة إشارات P تتحرك في اتجاه واحد فقط بدلاً من أن تتفرع عند منطقة دخول الجذر الظهري. كما كشفت هذه الدراسات أن تكوين co لا يتأثر في طفرات إشارات CG P، مما يشير إلى أن النوع الثاني من التفرع المحوري الملاحظ في عصبونات DGen يتم تنظيمه بشكل مختلف.

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

نحن لشرح استخدام المسدس لإدخال جينات الأصباغ الفلورية ، مثل الجاذبة ، في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح من القوارض والرئيسات غير البشرية من مختلف الأعمار. في هذه الحالة بالذات ، ونحن نستخدم فئران بالغة (3-6 أشهر من العمر) والقرود cynomologus الكبار (9-15 سنة). هذه التقنية ، ووصف في الأصل من قبل المختبر ليختمن الدكتور...

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

الخلايا العصبية الحسية تشجر شجيري...

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

نقدم تقنية الخلايا العصبية لوصفها واحد في الجهاز العصبي المركزي (CNS)...

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

نقدم هنا بروتوكولا محسنا للنمط الجيني وتلميث الفئران الجنينية وتلطيخها وإعدادها لتصوير الإسقاطات العصبية المحيطية لمستقبلات الألم في بأكمله ، كطريقة فعالة لتقييم الأنماط الظاهرية لنمو المحور العصبي الحسي في تطوير الفئران المعدلة وراثيا.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

هنا ، نقدم بروتوكولا للبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي بالإضافة إلى تحديد وعزل العقد الجذرية الظهرية المحددة (DRGs) في نفس القوارض. بالمقارنة مع طرق عزل الحبل الشوكي القياسية ، فإن هذه الطريقة أسرع بكثير وتقلل من خطر تلف الأنسجة.

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

في هذا التقرير، هي أبرز مزايا أورجانوتيبيك الثقافات والثقافات الأولية ينتابها من العقد الجذرية الظهرية المستمدة من الماوس للتحقيق في طائفة واسعة من الآليات المرتبطة بالخلايا العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، نيوروينفلاميشن، واستجابة للعدوى الفيروسية.

الكبار الماوس DRG Explant ونأت بنماذج الخلية للتحقيق في أعصاب والردود على الإهانات البيئية بما في ذلك العدوى الفيروسية

انهانسر نهج فعال لتوصيل الجينات المصالح إلى الخلايا. بتطبيق هذا النهج في فيفو على الخلايا العصبية العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار (DRG)، يصف لنا نموذجا لدراسة إكسون التجدد في فيفو.

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

يظهر هنا التطوير للحصول باستمرار على أقسام تبريد العقدة الجذرية الظهرية عالية الجودة.

إجراء للتشريح بالتبريد لجذر الجذر الظهري للفأر

تحتوي العقد الجذرية الظهرية (DRG) على أجسام خلايا عصبية حسية أولية وتنقل إشارات حسية محيطية إلى الحبل الشوكي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتشريح DRG للفأر تدعم العزل الموحد للعقد السليمة هيكليا، والتعرف التشريحي على المقطعات، والتوجيه الحدسي للمستخدمين المبتدئين، وتقليل إصابات الأنسجة الإجرائية.

تشريح وعزل عقد الجذر الظهرية للفأر

اكتشف أنماط التفرع المحوري لخلايا DRG في الحبل الشوكي الجنيني للفأر باستخدام تحضير الجبل الكامل. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تطور الأعصاب وآليات التفرع العصبي.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

استكشف المزيد من الفيديوهات