جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مستنبتات رفاتية نسيجية (organotypic raft cultures) من الخلايا الكيراتينية الأولية أو خطوط الخلايا الظهارية المستقرة. ويتم تحقيق ذلك من خلال صنع سدادات كولاجين ليفية أولاً، ثم وضع الخلايا الظهارية في طبقات فوق هذه السدادات.

تُنقل السدادات بعد ذلك إلى شبكات الرفوف وتُحفظ عند واجهة الهواء والسائل لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يومًا. وفي الخطوة النهائية، يتم حصاد الرفوف. وفي الختام، يمكن تقييم التغيرات في التمايز الظهاري عن طريق التحليل النسيجي أو الكيميائي النسيجي المناعي، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول التمايز الظهاري.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى، مثل الفيروسات التي تصيب الظهارة الجلدية أو المخاطية كجزء من دورة حياتها. وستقوم دان آنيكر، طالبة الدراسات العليا في مختبري، بشرح الإجراء. أولاً، صب حمض الكروميك الكبريتيك في دورق زجاجي واغمر شبكات الرافة المعدنية في الحمض لمدة ساعة واحدة.

ثم اشطف الشبكات باستمرار طوال الليل باستخدام ماء الصنبور. وبعد الشطف الليلي، اشطف الشبكات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس ساعات أخرى في ماء مقطر مزدوج، واترك شبكات الرف (raft grids) لتجف. بعد ذلك، قم بثني ثلاثة جوانب من الرف، بمسافة 0.5 centimeters تقريبًا تكون متساوية ومتباعدة عن بعضها البعض، ثم قم بتعقيم شبكات الرف باستخدام الأوتوكلاف.

بعد تحضير هلام الكولاجين، يتم استخدام التريبسين لتحرير الخلايا الليفية، ثم يتم تحييد التريبسين باستخدام الوسط الغذائي. تُنقل الخلايا الليفية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر، وتُعد الخلايا لتحديد عدد الطوافات التي يمكن تحضيرها. بعد ذلك، وبعد تدوير الخلايا بالطرد المركزي لمدة أربع دقائق عند 244 ×g في درجة حرارة الغرفة، يتم سحب الوسط الغذائي من كتلة الخلايا الليفية وإعادة تعليق الخلايا في كمية مناسبة من محلول إعادة التشكيل DMEM والكولاجين وفقاً لعدد الطوافات المحسوب.

يُضاف الكولاجين في النهاية لمنع الهلام من التصلب بسرعة كبيرة. وبمجرد إضافة الكولاجين، اخلط المحلول بسرعة ولكن بلطف لمنع تكون فقاعات داخل الهلام. إذا كان خليط الهلام يميل إلى اللون الأصفر بشكل زائد، أضف بضع قطرات من المحلول المعقم بالترشيح.

أضف وحدة واحدة من هيدروكسيد الصوديوم العادي. امزج برفق حتى يتحول الجل إلى لون برتقالي محمر يشير إلى الرقم الهيدروجيني (pH) الصحيح. الآن، استخدم الماصة لنقل 3 mL من خليط كولاجين الخلايا الليفية ببطء على جدار كل بئر في طبق زراعة بستة آبار، مع تجنب تكوين فقاعات، ثم حضّن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 °C للسماح للجل بالتصلب.

عندما يتصلب الهلام، أضف 3 mL من الوسط E المحتوي على EGF إلى سطح هلام الكولاجين المتصلب، ثم أعد الطبق إلى الحاضنة. بعد نمو الخلايا الكيراتينية ذات الممرات المنخفضة لتصل إلى نسبة تلاقي تبلغ 70% تقريبًا، يتم معالجة الخلايا الكيراتينية بالتريبسين، ثم يتم تحييد التريبسين باستخدام الوسط E المحتوي على EGF، ثم تُعد الخلايا لتحديد عدد الطوافات التي يمكن تحضيرها.

بعد تدوير الخلايا، أعد تعليق الراسب في 1 mL من eed مع EGF لكل مزرعة raft محسوبة. الآن، قم بإزالة الوسط من هلامات الكولاجين عن طريق إمالة الطبق ذي الستة آبار على جانبه، ثم أضف 2 mL من eed الطازج مع EGF إلى كل هلام. بعد ذلك، أضف بعناية 1 mL من الخلايا الكيراتينية المعاد تعليقها إلى الـ 2 mL من eed الموجودة مسبقاً في كل بئر من الآبار.

انقل الخلايا الكيراتينية مع 2 mL من الوسط الغذائي برفق باستخدام الماصة، واتركها تسقط على شكل قطرات فوق سدادة الكولاجين. ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من يومين إلى أربعة أيام للسماح للخلايا بالنمو حتى تصل إلى مرحلة التلاقي. تصبح الخلايا جاهزة عندما يتغير لون الوسط الغذائي إلى الأصفر بعد يوم واحد من استبداله، أو بحلول اليوم الرابع، استخدم ملقطاً معقماً لوضع شبكة معدنية معقمة في طبق بقطر 10 cm بحيث تكون الجوانب المنحنية للأسفل.

قم بشفط الوسط من أحد هلامات الكولاجين، ثم حرك ملعقة معقمة حول محيط الهلام بحركة صعود وهبوط لفصله عن جوانب البئر. إن نقل سدادة الكولاجين من طبق الست-آبار إلى الشبكة هو الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. احرص على تمرير الملعقة برفق أسفل السدادة دون تقسيمها، ووضعها بشكل مسطح على الشبكة دون تكوين أي فقاعات هوائية بين السدادة والشبكة.

بعد ذلك، يمكنك استخدام ملعقة مختبرية (spatula) لتسوية أي أجزاء قد تكون انطوت أثناء هذه العملية. لإزالة الهلام، قم بإمالة الطبق قليلاً، ثم ضع الملعقة المختبرية تحت الهلام وارfعه. ضع هلام الكولاجين على الشبكة المعدنية دون تكوين فقاعات بين الشبكة والهلام.

لإنشاء واجهة هوائية سائلة، أضف EED بدون EGF ببطء إلى قاع الطبق بحيث تلامس شبكة الرفوف الوسط الغذائي، بينما لا يلامسه جل الكولاجين. وأخيراً، قم بحضن الرفوف عند 37 درجة مئوية. مع الحفاظ على الواجهة الهوائية السائلة، يتم حصاد الرفوف بعد 14 يوماً. وكما يتضح في هذا الشكل، فإن الرفوف المصنعة من خلايا keratinocytes بشرية أولية مُخلدة بواسطة HPV 31 أو H fk، 30 تكون أكثر سمكاً بشكل ملحوظ مقارنة بالرفوف المصنعة من خلايا keratinocytes بشرية طبيعية من الجلد أو hks.

وبالتالي، تمتلك بروتينات HPV القدرة على إبقاء الخلايا المتمايزة نشطة في دورة الخلية. هنا، تم إجراء تحليل كيميائي نسيجي مناعي على مقاطع عرضية من زراعات الطوف العضوية الناتجة من خلايا HK 30 وكذلك خلايا HKS الطبيعية، وذلك باستخدام جسم مضاد ضد cytokeratin 10 أو K 10 باللون الأخضر. لم يتم التعبير عن K 10 في الطبقة القاعدية المشار إليها هنا بالأسهم، وبدلاً من ذلك، وُجد فقط في الطبقات فوق القاعدية، والتي تتكون من خلايا تتمايز تدريجياً.

في هذا الشكل، يظهر تعبير بروتين HPV، E1 و E4، وهو بروتين متأخر يقتصر وجوده على الطبقات العليا من الظهارة وممثل هنا باللون الأخضر، كما هو متوقع. ولا يُلاحظ وجود أي صبغ في مزارع الـ raft من خلايا hks الطبيعية، كما في الشكل السابق.

تشير الأسهم مرة أخرى إلى الطبقة القاعدية للظهارة بعد نموها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لدراسة إمراضية الفيروسات الحليمية البشرية باستخدام نظام يحاكي التمايز الظهاري في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إعداد مزارع الرقائق النسيجية العضوية من الخلايا الكيراتينية الأولية أو خطوط الخلايا الظهارية المستقرة.