تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

الهدف العام من هذا الإجراء هو استزراع مستأصلات (explants) من الجسم المخطط (striatum) والدماغ المتوسط الدوباميني لدراسة تطور مسار Meso Sal و Sal Nigro. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التشريح المجهري للجسم المخطط والدماغ المتوسط الدوباميني من أجنة الفئران في اليوم الجنيني E 14.5. والخطوة الثانية هي قطع مستأصلات ذات حجم مناسب من الأنسجة التي تم تشريحها.

بعد ذلك، يتم وضع القطع النسيجية ضمن هلام الكولاجين على مسافة قريبة جداً من بعضها البعض. والخطوة النهائية هي استزراع هذه القطع النسيجية على مدى فترة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام للسماح بنمو المحاور العصبية. وفي النهاية، يُستخدم الكيمياء النسيجية المناعية لعلامات عصبية محددة لإظهار وقياس استجابات المحاور العصبية سواء كانت جذابة أو طاردة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مزارع المستأصلات المنفصلة أو مزارع DX الثنائية، في أن مصفوفة الكولاجين توفر ركيزة ثلاثية الأبعاد للإكسونات تحاكي البيئة خارج الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح مصفوفة الكولاجين بتكوين تدرجات مستقرة نسبياً من البروتينات التي تفرزها مستأصلات X أو الخلايا الموجودة في الجوار. ستقوم أفا سميث وفرانشيسكا، وهما طالبتان في مرحلة الدراسات العليا من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء.

لبدء هذا الإجراء، قم بتشريح أجنة الفئران في اليوم الجنيني E 14.5 من رحم الأم. احتفظ بها في وسط L 15 على الثلج حتى حين الحاجة إليها. بعد ذلك، انقل جنيناً إلى المجهر، وافصل الدماغ عن الجنين.

ثم قم بإزالة الرأس عن طريق القص على طول الجزء الإنسي من كل حويصلة رأسية. بعد ذلك، قم بإزالة الغمد السحائي. قم بإجراء شق ظهري بطني أمام الثنية الرأسية الإنسية مباشرةً.

بعد ذلك، قم بإجراء قطع ظهري بطني آخر بجوار الثنية الرأسية مباشرةً. ثم قم بإجراء قطع عرضي بجوارها على طول الخط المتوسط الظهري باستخدام سكين التشريح الدقيق للكشف عن أنسجة الدماغ المتوسط البطنية الموجودة أسفلها. يجب الحذر من إصابة أنسجة الدماغ المتوسط البطنية لأنها تحتوي على العصبونات الدوبامينية.

بعد ذلك، قم بإجراء قطعين عرضيين في الجزء العلوي بشكل جانبي وموازٍ للخط الناصفي البطني لإزالة نسيج الدماغ المتوسط الظهري. بعد ذلك، قم بتقسيم نسيج الدماغ المتوسط البطني المتبقي إلى X من المستنبتات باستخدام سكين تشريح مجهري في النهاية. يتم تخزين المستنبتات X في وسط L 15 الذي يحتوي على 5%FBS على الثلج حتى وقت الاستخدام.

الآن، انقل الحويصلات الرأسية (cephalic vesicles) للطحال التي تم الحصول عليها سابقاً أثناء تشريح الدماغ المتوسط إلى المجهر. قم بإزالة المهاد عن طريق القطع بين المهاد والمنقرة باستخدام ملقط. ثم قم بإجراء قطع إنسي-وحشي (medial lateral) أمام المخطط لإزالة الهياكل الأمامية مثل البصلة الشمية.

بعد ذلك، كرر هذه الخطوة للأنسجة الموجودة بجانب الجسم المخطط. بعد ذلك، ضع الشريحة المتبقية للحصول على عرض إكليلي للجسم المخطط. يمكن تمييز الجسم المخطط كجزء أكثر شفافية قليلاً من النسيج.

بعد ذلك، قم بعزل الجسم المخطط، ثم قطعه إلى غرسات باستخدام سكين التشريح الدقيق. تجنب الأنسجة الداكنة قليلاً القريبة من الخط الناصف، حيث تحتوي على الخلايا العصبية المهاجرة من البروز العقدي الجانبي والإنسي. أضف قطرة من الكولاجين المُحضّر إلى شريحة غطاء في بئر من أطباق ذات أربعة آبار.

احتفظ بها في الحاضنة عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة 30 دقيقة. سيتجمد الكولاجين ويتحول إلى جيلاتين خلال هذه الحضانة. بعد تحول الكولاجين إلى جيلاتين، استخدم ماصة ذات رأس سعة 200 µL لنقل مستنبتات الخلايا الدوبامينية أو sal إلى الكولاجين.

بعد ذلك، قم بتقريب المستنبتات من بعضها البعض باستخدام إبرة. حافظ على مسافة فاصلة بينها تعادل تقريبًا قطر مستنبت واحد. تلى ذلك إزالة الوسط الزائد.

أضف 20 µL من الكولاجين المُحضّر فوق المستنبتات النسيجية. وغالباً ما يؤدي ذلك إلى تحرك المستنبتات من مكانها؛ لذا قم بإعادة ضبط موضع المستنبتات باستخدام إبرة.

اترك الكولاجين ليتماسك في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم انقله إلى حاضنة عند 37 °C مزودة بـ 5% carbon dioxide لمدة 30 دقيقة. بعد أن يتماسك الكولاجين، أضف 400 µL من وسط الاستزراع (explan medium) واتركه لينمو لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في الحاضنة عند 37 °C.

لتثبيت العينات برفق، أضف 4% para formaldehyde واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة واحدة، اغسل العينات في PBS في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات، ولمدة 15 دقيقة في كل مرة.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS، ثم حضن العينات في محلول الحجب لمدة ساعتين. بعد ذلك، يتم تحضينها طوال الليل مع الجسم المضاد الأولي ومحلول الحجب عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اغسل العينات باستخدام PBS خمس مرات في درجة حرارة الغرفة، ولمدة ساعة واحدة في كل مرة. ثم حضنها مع الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالفلوروفور المناسب.

تُترك في محلول الحجز طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ومنذ هذه الخطوة فصاعداً، تُغطى المستنبتات بورق ألومنيوم لتقليل تعرضها للضوء. تُغسل طوال الليل في PBS عند درجة حرارة 4 °C، تليها عدة غسلات في اليوم التالي.

بعد ذلك، قم بتثبيت المستأصلات على شريحة المجهر باستخدام وسط تثبيت من كاشف مضاد للتلاشي ممتد المفعول، مع توجيه جانب المستأصل ليكون للأسفل. ضع غطاء الشريحة فوق وسط التثبيت برفق شديد لتجنب حبس أي هواء تحته. ثم التقط صوراً رقمية للمستأصلات x باستخدام مجهر فلوري انعكاسي.

باستخدام هذه الصور، قم بتقسيم كل مستنبت X إلى أرباع من أجل إنشاء ربع قريب وربع بعيد. بعد ذلك، قم بقياس طول أطول 20 نتوءاً عصبياً خارجة من مستنبت X، في كل من الربعين القريب والبعيد. استخدم متوسط طول أطول 20 نتوءاً عصبياً لحساب نسبة القرب إلى البعد لكل مستنبت على حدة.

تشير نسبة القريب إلى البعيد عندما تكون أكبر من واحد إلى جذب المحوار، بينما تشير النسبة عندما تكون أقل من واحد إلى تنافر المحوار. يظهر هنا شرح للدماغ المتوسط مصبوغ بجسم مضاد ضد تيروزين هيدروكسيلاز، مما يكشف عن نمو المحوار.

يشير الخط المنقط إلى المستنبتات المجاورة. وتشير الأسهم هنا إلى المحاور العصبية ومخاريط النمو الفردية. وهذا مثال على قياس نسبة القريب إلى البعيد.

يتم تقسيمها إلى أرباع متساوية. يواجه الربع القريب طعوم X المجاورة، بينما يواجه الربع القاصي بعيداً عنها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الزراعة المشتركة لطعوم الخلايا الدوبامينية والخلايا المخططية لاستقصاء تطور المسار النيجرومخططي، ودراسة الآليات الجزيئية المشاركة في تكوين هذه المسارات.