تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تأثيرات التعرض للإيثانول على أسماك الزيبرا في مرحلة النمو. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض أسماك الزيبرا أولاً لجرعات من الإيثانول في مياه أجنة طبيعية خلال مراحل النمو المبكرة، ثم يتم إزالة الإيثانول وتُترك الأسماك لتنمو حتى النقطة الزمنية المطلوبة.

بعد ذلك، يتم فحص كل من التغيرات الفيزيائية العيانية والتعديلات في التعبير الجيني في الأجنة المعالجة مقارنة بالأجنة الضابطة. وأخيرًا، يتم معالجة الأجنة باستخدام mRNA، أو المورفولينوات، أو العقاقير لتحديد ما إذا كان من الممكن تغيير العيوب التنموية الناتجة عن الإيثانول. وفي نهاية المطاف، أظهر الجمع بين تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) والتهجين الموضعي (in situ hybridization) أن تأثيرات الإيثانول على أجنة أسماك الزيبرا النامية مرتبطة بتغير في التعبير الجيني.

قد يؤدي التلاعب اللاحق بمستويات التعبير الجيني إلى تحسين أو منع العيوب التنموية الناتجة عن الإيثانول. إن التقنيات التي نعرضها اليوم توسع معرفتنا بطبيعة متلازمة الجنين الكحولية، بالإضافة إلى الحفاظ على العمليات التنموية في الفقاريات. ستقوم ستيف إرهاردت، الفنية في مختبري، بالشرح اليوم حول كيفية معالجة الأجنة بالإيثانول.

قم بتربيتها من تزاوجات النوع البري وصولاً إلى مرحلة القبة عند 28 درجة Celsius في ماء الأجنة. وزع الأجنة من مجموعة واحدة على العدد المطلوب من الأطباق، بحيث يحتوي كل طبق على ما بين 10 و 50 جنينًا. أضف إلى الأجنة محلولًا من الإيثانول بتركيز يتراوح بين 0.2 إلى 2.5% حجم/حجم في ماء الأسماك، ثم أعدها إلى الحاضنة لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد فترة التعرض المطلوبة.

استبدل الإيثانول المحتوي على الماء بماء أجنة طازج لفترة نمو محددة لجمع mRNA من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR). ضع الأجنة المتطابقة H في أنابيب إبـينور. قم بإزالة مياه الأسماك وأضف محلول التحلل (lysis buffer) مع TCEP.

باستخدام مسحوق آلي، قم بفصل الأجنة ميكانيكياً ثم ضعها في جهاز الطرد المركزي لإجراء عملية دوران بطيئة. انقل المذاب إلى عمود تنقية أولية، ثم قم بطرد العمود مركزياً؛ وذلك لإزالة القطع الكبيرة المفصولة.

استخدم طقم عزل RNA لاستخلاص الـ RNA. بعد ذلك، قم بتخليق cDNA باستخدام الطرق القياسية لتحليل QPCR أو مصفوفة مجهرية (microarray) لتحضير الأجنة لعمليتي التهجين الموضعي (in situ hybridization) والتلوين بالأجسام المضادة. قم بتثبيت الأجنة في المرحلة من 6 إلى 24 ساعة بعد الإخصاب في 4% paraformaldehyde طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، وذلك بعد إجراء ثلاث عمليات غسيل باستخدام PBS مضاف إليه 0.1% tween.

أزل الغشاء الكوريوني باستخدام ملقطين حادين تحت المجهر. بعد ذلك، انقل الأجنة إلى الميثانول عبر سلسلة من عمليات تغيير السائل بتركيز متزايد من الميثانول وتركيز متناقص من PBT. بعد نقل الأجنة إلى ميثانول بتركيز 100%، احفظها عند درجة حرارة -20 °C لصبغ الغضاريف.

يتم تربية الأجنة حتى اليوم الخامس أو السادس بعد الإخصاب. ثم يتم تثبيتها طوال الليل في 4%paraform aldehyde عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. بعد ذلك، تُغسل ثلاث مرات في PBT لتحديد مستويات التعبير الجيني التي تغيرت نتيجة التعرض للإيثانول.

أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (QPCR) من خلال تصميم البادئات أولاً للتحقق من صحتها. اختبر هذه البادئات على ثلاث عينات بيولوجية. يمكن أن تكون هذه العينات البيولوجية الضابطة من أي عمر طالما أن الجين المستهدف يتم التعبير عنه في ذلك العمر المحدد.

بمجرد التحقق من البادئات، استخدم cDNA الذي تم تحضيره مسبقاً لإجراء QPCR مع تشغيل العينات في ثلاث مكررات وتضمين عينة ضابطة لسمك الزيبرا؛ نستخدم البادئات الخاصة بـ gap dh. قم بتطبيع النتائج وفقاً لمستويات gap DH، ثم احسب المستوى النسبي للتعبير الجيني باستخدام طريقة 2⁻ΔΔCt.

تغير في طريقتين من طرق delta delta CT يظهر الفرق في العينة التجريبية بالنسبة للنوع البري. في C، يوجد بناء تهجين. مسابير ribo موسومة بالديجيتال للجين المستهدف.

بعد ذلك، يتم تحضينها مع أجنة متكافئة في العمر باستخدام ظروف قياسية، ويتم الكشف عن نمط التهجين باستخدام الفوسفاتاز القلوي. صوِّر العينات باستخدام مجهر تشريحي لتقييم التطور المورفوجيني، مثل شكل الرأس. صوِّر الأجنة الحية لتقييم المسافة بين العينين وطول الجسم. أولاً، قم بتثبيت الأجنة في البارافورمالدهيد. ثم اجمع الصور لفحص تأثيرات المعالجة بالكحول على تراكيب الغضاريف النامية في اليرقة المصبوغة.

ثبتت أسماك الزيبرا باستخدام lc واللون الأزرق لعدة ساعات أو طوال الليل لتثبيت الأجنة وتصفيتها قبل التصوير. قم بتحليل موت الخلايا في الأجنة الحية عن طريق تحضينها في 5 mg/mL من aine orange في PBS لمدة ساعة واحدة. اغسل الأجنة ثلاث مرات في PBS، ثم قم بتثبيت الأجنة على شرائح، وصور العينات باستخدام مجهر كونفوكال واستخدم Z series لإنشاء صور مركبة.

بعد تحديد الجينات التي انخفض تعبيرها نتيجة التعرض للإيثانول، يتم حقن ما بين 25 إلى 200 picograms per nanoliters من mRNA المغلّف للجين المستهدف في مرحلة الخلية الواحدة أو الخليتين. تُترك البيوض لتتعافى في حاضنة مسخنة عند 28 °C حتى تصل إلى مرحلة القبة (dome stage)، ثم تُعالج بالإيثانول كما سبق. أما بالنسبة للجينات التي زاد تعبيرها نتيجة التعرض للإيثانول، فيتم تثبيطها عن طريق حقن كميات تتراوح من picogram إلى nanogram من antisense morphos في أجنة في مرحلة الخلية الواحدة أو الخليتين.

يُعد هذا البروتوكول مشابهاً لبروتوكول mRNA المقترن بـ cap. في حال حقن mRNA أو morpho الخاص بالتوصيل، يتم قياس الكفاءة باستخدام R-T-P-C-R لمقارنة كميات النسخ الموصلة وغير الموصلة لتحليل نشاط الجين المعتمد على الجرعة، مع معايرة الـ morino المحقون والسماح للأجنة بالنمو حتى المرحلة المطلوبة قبل معالجتها بالإيثانول. يؤدي تعريض أجنة Zebra fish للإيثانول إلى ظهور عدد من العيوب التنموية والوراثية التي ترتبط بالأنماط الظاهرية الموجودة في الفقاريات الأخرى.

يؤدي التطور غير الطبيعي للأنسجة المحورية، بما في ذلك Noor، إلى تقصير والتعطيل أحياناً لـ noord، وهو ما يؤدي جزئياً إلى التشوهات اللاحقة في الجسيدات (somites) كما هو موضح هنا. وبينما تمتلك الضوابط غير المعالجة شكلاً قوياً يشبه حرف V (chevron shape)، فإن الجسيدات المعالجة بالإيثانول تتخذ المظهر الذي يشبه حرف U والملاحظ عند انخفاض إشارات sonic hedgehog. كما يظهر هنا.

ومن النتائج الأخرى للتعرض للإيثانول، والتي قد تكون تالية للتأخر النمائي المبكر وما يتبعه من عيوب في Noor، قصر طول الجنين. وتتشابه هذه النتيجة مع استمرار مرحلة ما قبل البلوغ وقصر القامة الملاحظ لدى الأطفال الذين تعرضوا للإيثانول أثناء النمو، مما يشير إلى أن نموذج سمك الزيبرا ملائم لفهم هذا العيب الخلقي البشري. وقد ثبت في النماذج الحيوانية أن التعرض الشديد للإيثانول يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرة واضحة لمتلازمة الجنين الكحولية، بما في ذلك synthia و opia.

في سمك الزيبرا، تتناقص المسافة بين العينين (IOD) بطريقة تعتمد على جرعة الإيثانول، وهو ما يتوافق مع طبيعة العيب الخلقي لدى البشر. ولا تظهر حالة انعدام العينين (Opia) إلا مع الجرعات العالية جداً، إلا أن الجرعات المنخفضة تؤدي إلى انخفاض ملحوظ في المسافة بين العينين، مما يشير إلى أن هذا النموذج الحيواني يعاني من عيب مماثل في تطور الخط المتوسط للوجه. وفي هذا الشكل، تتم مقارنة مستويات التعبير الجيني المبكر لكل من six three B و glee one في الأجنة غير المعالجة والأجنة المعالجة بالإيثانول.

أظهر كلا الجينين انخفاضاً في مستويات التعبير في العينات المعالجة بالإيثانول. وباستخدام التهجين المزدوج NC، تم تحليل أنماط التعبير لـ six 3 B و gooID كما هو موضح. وهنا، أظهر كلا الجينين انخفاضاً في التعبير المكاني في الأجنة المعالجة بالإيثانول مقارنة بمجموعات التحكم غير المعالجة.

نظرًا لأن كلا الجينين يتم التعبير عنهما في الأنسجة المقدر لها أن تصبح أنسجة خط المنتصف القحفي الوجهي C، فإن انخفاض مستوياتهما بعد ثماني ساعات من الإخصاب يتسق مع انخفاض IOD في مرحلة لاحقة من النمو. وبمجرد تحديد الجينات التي تتأثر بالإيثانول، تتوفر آليات يمكن من خلالها زيادة تعبيرها أو تقليله. وفي هذا المثال، تم حقن mRNA الخاص بـ sonic hedgehog، وهو ربيطة تزيد من مستويات glee one، وقد أدى ذلك إلى إنقاذ العيوب الشكلية الناتجة عن انخفاض glee one في الأجنة المعالجة بالإيثانول.

ومع ذلك، فإن حقن six three B لم يتمكن من إنقاذ النمط الظاهري الناتج عن التعرض للإيثانول. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استكشاف العيوب الجينية والتنموية التي يسببها الإيثانول في جنين سمكة الزيبرا النامي. كما يمكن تطبيق التقنيات المستخدمة هنا من قبل الراغبين في دراسة سمية المركبات الأخرى القابلة للذوبان في الماء على جنين الفقاريات النامي.