الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحفظ بالتجميد لنطاف الفئران. ويتم تحقيق ذلك من خلال جمع النطاف أولاً من البريديمات المبيضة (EPIs) للفئران باستخدام أنابيب الحفظ بالتجميد. ثم تُجمد هذه الأنابيب في النيتروجين السائل حيث تُخزن إلى حين استعادتها عن طريق إذابتها في ماء دافئ.

تُستخدم نطاف الفئران المستعادة في نهاية المطاف لعملية الإخصاب في المختبر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه المجموعة مقارنة بالطرق الحالية في أنها تحتوي على جميع المواد اللازمة لتجميد نطاف الفئران واستعادتها؛ وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في التعامل مع أنابيب التجميد وتعبئتها. ابدأ بتجهيز 15 أنبوب تجميد للنطاف لكل سلالة من الفئران المراد تجميد نطافها.

أولاً، قم بتوصيل كل ماصة سعة 0.25 milliliter بحقنة سعة one milliliter، بحيث تكون السدادة القطنية هي الأقرب إلى الحقنة. ثانياً، قم بتعبئة ثمانية سنتيمترات من وسط IVF في كل ماصة، يليه سنتيمتر واحد من الهواء. ثالثاً، ضع ملصقاً على كل ماصة من الماصات الـ 15 يوضح اسم السلالة المراد حفظها لكل سلالة سيتم تجميدها.

املأ بئراً في طبق يحتوي على أربع آبار بـ 240 µL من عامل الحماية من التجمد. قم بتثبيت ماصة سعة 1 mL بمقبض حاوية التجميد لإطالة المقبض. وأخيراً، املأ الصندوق المعزول بالرغوة المرفق مع الطقم بـ 15 cm من النيتروجين السائل ثم أغلق الغطاء.

فأران بالغان ذكران خصبان. لكل سلالة سيتم حفظها بالتجميد، قم بإزالة الغدد الصنوبرية (EPIs) من الخصيتين جراحيًا. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري وافتح جدار الجسم البطني.

اسحب التلافيف الواسعة برفق وأزل أي دهون زائدة. بعد ذلك، حدد موقع البربخ وأزله كاملاً مع قطعة صغيرة من التلافيف الدهنية. ضع البربخ (EPIs) في إحدى فجوات طبق رباعي الفجوات المجهز مسبقاً والمملوء بـ CPA تحت مجهر تشريحي.

قم بإجراء خمسة إلى سبعة شقوق طولية في كل بربخ. ثم باستخدام الملقط، اضغط برفق على كل شق. ولإخراج الحيوانات المنوية، قم بحضن خليط الـ CPA والبربخ في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

قم برج الطبق برفق يدويًا مرتين إلى ثلاث مرات أثناء فترة الحضن. سيسمح ذلك للحيوانات المنوية بالخروج عن طريق الشفط. املأ كل قشة مُجهزة بـ 5 mm من معلق الحيوانات المنوية، يتبعها 1 cm من الهواء.

من المهم لعملية التجميد أن يتم تحميل جميع القشات بالتساوي. بعد تحميل جميع القشات الـ 15، قم بإغلاق كلا طرفي كل قشة بعناية باستخدام الختم الحراري. ولضمان بقاء الحيوانات المنوية على قيد الحياة، يجب إتمام هذه العملية لجميع القشات الـ 15 في غضون 10 دقائق.

بمجرد تحضير جميع القشات، قم بتحميلها في عمود الحيوانات المنوية داخل وعاء التجميد. أولاً، ضع الوعاء في الصندوق الرغوي واتركه يطفو رأسياً في النيتروجين السائل. يجب أن يطفو الوعاء رأسياً لمدة 10 دقائق، وإلا سيتأثر معدل تجميد الحيوانات المنوية.

بعد ذلك، اغمر العبوة في النيتروجين السائل. وبذلك يتم حفظ النطاف بالتجميد وتصبح جاهزة للتخزين طويل الأمد في النيتروجين السائل. قبل 60 ساعة تقريبًا من عملية استعادة النطاف المخطط لها.

اتبع البروتوكول المكتوب لتحفيز التبويض لدى الإناث قبل عملية التلقيح الاصطناعي (IVF). وبالنسبة لكل قشة سيتم إذابتها، قم بتحضير وموازنة جميع الأوساط لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون. تشمل هذه المواد طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على قطرة بحجم 90 µL من وسط معالجة الحيوانات المنوية مغطاة بالزيت.

استخدم طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على ثلاثة مليلتر من وسط IVF ليكون طبقاً للتقطيع، وقم بتجهيز طبق IVF لكل خمس إناث خضعن للتحفيز المبيضي المفرط، وهو عبارة عن بئر واحد من طبق يحتوي على أربعة آبار ومملوء بـ 500 ميكرولتر من وسط IVF. ولكل طبق IVF، جهز طبق غسيل وهو عبارة عن طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على ثلاثة مليلتر من KSOM، وطبق استزراع للأجنة وهو عبارة عن طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على قطرات بحجم 50 ميكرولتر من وسط KSOM مغطاة بالزيت. وبعد تجهيز جميع المواد المطلوبة، أخرج سريعاً القشة من التخزين وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

جفف القشة. ثم قم بإجراء قطع مائل في عمود الهواء الموجود أسفل سدادة القطن. وفي الطرف الآخر من القشة، قم بإجراء قطع مائل آخر فوق عمود هواء آخر.

تجنب قطع عمود الحيوانات المنوية. الآن، قم بسحب معلق الحيوانات المنوية من نهاية القشة باستخدام ماصة سعة 200 µL، وضعه في مركز قطرة وسط معالجة الحيوانات المنوية. بعد ذلك، قم بحضن الطبق لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة.

أثناء حضانة الحيوانات المنوية، قم بعزل القنوات الناقلة للبويضات (ucs) من الإناث التي خضعت لفرط التبويض وانقلها إلى طبق القطع. استخدم إبرة قياس 30 أو ملقطاً لتمزيق كل قناة ناقلة للبويضات لتحرير مجمعات الخلايا المكمشية (cumulus cyte complexes). انقل مجمعات الخلايا المكمشية (C Cs) من خمس إناث إلى كل وعاء للتلقيح الاصطناعي في المختبر (IVF).

حسنًا، وبأقل كمية ممكنة من الوسط الغذائي. تجنب نقل الدهون والدم لأن الأوساط الملوثة تثبط كفاءة الإخصاب. بعد فترة الحضانة، اجمع من 10 إلى 15 µL من معلق الحيوانات المنوية من محيط قطرة STM وأودع المعلق في أنبوب IVF واحد.

الآن، قم باستزراع الخلايا معاً لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات لإتمام عملية الإخصاب. بعد الإخصاب، مرر الأجنة عبر غسلات SOM بمقدار 2K على الأقل في طبق الغسيل. ثم ابدأ عملية الاستزراع.

تُحفظ الأجنة في وسط KSOM حتى الوصول إلى المرحلة التطورية المطلوبة. تم تجميد الحيوانات المنوية من خمس سلالات نقية من فئران Charles River. وتراوحت نسب الحماية لحركية الحيوانات المنوية والحركية التقدمية السريعة من 81% إلى 47% عبر السلالات الخمس من تلك الحيوانات المنوية.

تفاوتت معدلات التلقيح الاصطناعي في المختبر (IVF) باستخدام الحيوانات المنوية المجمّدة والمذابة في السلالات المختلفة من 26 إلى 88% على مدار عام ونصف. وتم أرشفة ما مجموعه 49 سلالة من الفئران المعدلة وراثياً (GM) عن طريق الحفظ بالتجميد للحيوانات المنوية، ثم استعادتها لاحقاً بواسطة التلقيح الاصطناعي في المختبر في أربع سلالات مختلفة من الإناث: C 57 black six و BC DBA one و 1 29 SV. وبمجرد إتقان تقنية الحفظ بالتجميد للحيوانات المنوية، يمكن إتمام العملية في غضون 30 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح.

في هذا الإجراء، من المهم أن يتدفق النيتروجين السائل إلى العلبة عمودياً.