التحليلية تقنيات يعاير النيتريك النشاط الحيوي أوكسيد

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح كيفية الكشف بدقة وتحديدا عن مستقلبات أكسيد النيتريك في العينات البيولوجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة عينات الدم أولا بعد جمعها مباشرة لمنع فقدان المستقلبات أو تكوين القطع الأثرية. في الوقت نفسه ، يتم إجراء حصاد سريع وفعال للأنسجة لتقليل آثار البيئة الناقصة للأكسجين على مستقلبات أكسيد النيتريك.

يتم جمع حلقات الأبهر وتعليقها في حمام الأعضاء لتقييم وظيفتها البطانية. علاوة على ذلك ، تستخدم المقايسات الكيميائية الحيوية لتحديد مستويات النترات ومستويات النتريت والمستويات النسبية للنيترو ثيول وغيرها من المنتجات المشبعة بالنيترو في الأنسجة. باستخدام هذه المقايسات ، يمكن أن تولد المقارنة المناسبة بين التجربة الضابطة معلومات قيمة عن إنتاج أكسيد النيتريك والتمثيل الغذائي.

الميزة الرئيسية لاستخدام هذا النهج متعدد الأنظمة على الطرق أو المقايسات الفردية هي أن هذا من شأنه أن يسمح بصورة أوسع للكيمياء الحيوية لأكسيد النيتريك في أنظمة الأعضاء المتعددة. لذلك يمكننا أن نبدأ في فهم أي من هذه المستقلبات قد يكون له فائدة تنبؤية أو تشخيصية ، وكيف تعكس ذخيرة مستقلبات أكسيد النيتريك تكوين أكسيد النيتريك البطاني وتوافره. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن كل خطوة في العملية ضرورية للحفاظ على سلامة العينة.

بعض هذه الخطوات غير واضحة من قسم طرق القراءة في المجلة النموذجية بسبب التفاصيل الدقيقة لجمع العينات واستخراج الأنسجة. يوضح هذا الإجراء الدكتور هونغ جينغ. عالم أبحاث كبير في مختبري لهذا البروتوكول لديه شخص أو تجريبي لجمع الدم لحيوانات التجارب التي سيتم أيضا فحص أنسجتها.

أولا ، اجمع الدم الكامل عن طريق إدخال إبرة قياس 25 في الوريد الأجوف السفلي. بمجرد جمع 500 إلى 1000 ميكرولتر ، قم بتغذية خاليا من الدم المتبقي عن طريق ضخ عازلة فسيولوجية عبر قمة البطين الأيسر والسماح باستبدال الدم بالكامل كخروج الدم والمخزن المؤقت من خلال الوريد cva السفلي. يجب جمع الدم الوريدي في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل تحتوي على NEM و EDTA مباشرة بعد التجميع.

قم بتدوير الدم عند 14 ، 300 RCF لمدة سبع دقائق بعد الطرد المركزي. استنشق البلازما من حبيبات كرات الدم الحمراء بماصة وانقلها إلى أنبوب منفصل. قم بإعداد عينات البلازما المعزولة ل HPLC عن طريق إضافة حجم واحد إلى واحد من الميثانول البارد إلى 50 ميكرولترا من مجموعة البلازما.

دوامة ، الخليط بقوة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان حتى يصبح غائما. ثم الطرد المركزي الخليط عند 14 ، 300 RCF لمدة سبع دقائق. لترسيب بروتينات البلازما ، اجمع السوبر في أنبوب منفصل سعة 1.5 مليلتر وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية حتى يمكن تحليله.

لتحضير البلازما لتحليل التلألؤ الكيميائي ، خذ حجم البلازما المتبقي ، والذي يجب أن يكون حوالي 200 إلى 400 ميكرولتر وقم بتقسيمه إلى مجلدين. تحضير نصف البلازما عن طريق إضافة حجم 10٪ من 5٪ كبريتيد محمض ، والانتظار 10 دقائق. هذه العينة جاهزة الآن لتحليل CLD.

تحضير النصف الآخر من البلازما عن طريق إضافة 10٪ حجم من 2٪ كلوريد الزئبق بعد خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف 10٪ من السلفوناميد المحمض. انتظر 10 دقائق أخرى وحقن هذه العينة في CLD مثل البلازما.

يمكن تحضير حبيبات كرات الدم الحمراء ل HPLC و CLD لأي من التحليلين. ابدأ بخلط جزء واحد من الحبيبات الخلوية إلى أربعة أجزاء من محلول التحلل المنخفض التوتر. دوامة الخليط جيدا لتحليل CLD.

تحضير الخلايا هو نفسه الذي يتم إجراؤه للبلازما. ابدأ بإضافة كمية متساوية من الميثانول. ثم قم بتدوير الخليط بقوة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان ، متبوعا بتدويره لمدة سبع دقائق عند 14،300 RCF.

الآن قم بإخراج المادة الطافية وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى يمكن تحليلها بواسطة HPLC لتحديد مستويات الأنسجة من مستقلبات أكسيد النيتريك. في الأنسجة ذات الأهمية من التجارب ، يجب أولا حصاد الدم وتحضيره كما هو موضح في القسم السابق ، ويجب أن يتم حصاد الأنسجة كالمعتاد مع إيلاء اهتمام خاص للسرعة والكفاءة حتى لا تصبح الأنسجة منخفضة الأكسجين. بمجرد جمعها ، قم بتجانس عينات الأنسجة بنسبة واحدة إلى خمسة من N-E-M-E-D-T-A المحتوية على PBS.

ثم قم بإعداد الأنسجة المتجانسة لتحليل HPLC و CLD كما هو موضح في الأقسام السابقة لكرات الدم الحمراء. بعد تخدير الفأر البالغ باستخدام داثيل الأثير والتأكد من أنه لا يستجيب لقرصة إصبع القدم ، قم بإجراء بضع الصدر. يتم إجراء شق خط الوسط من القص وصولا إلى منطقة العانة لكشف تجاويف الصدر والبطن.

بعد ذلك ، قم بتفريم باستخدام عازلة Krebs Alite المؤكسجة. استخدم حقنة قياس 25 لحقن المخزن المؤقت في قمة البطين الأيسر. مع فتح الأذين الأيمن لتوفير مخرج للدم.

بعد التروية ، اعزل الشريان الأورطي البطني عن طريق قطع وإزالة الكبد والرئتين والأنسجة الأخرى التي قد تغطي الشريان الأورطي. بعد ذلك ، أمسك القلب بزوج من الملقط واقطع الشريان الأورطي من الجدار الخلفي للحيوان بطريقة لطيفة. ضع القلب والشريان الأورطي في طبق بتري مليء بالثلج.

عازلة كريبس الباردة في الطبق. قم بقطع الدهون والسكر من الشريان الأورطي ونظفها بعناية. تجنب إتلاف البطانة داخل الوعاء أثناء التنظيف.

حافظ على بطء استقلاب الشريان الأورطي لمنع نقص الأكسجة عن طريق نقله إلى محلول عازل مؤكسج مثلج بارد طازج كل خمس دقائق. استخدم الآن مشرطا لتقطيع الشريان الأورطي إلى شرائح على شكل حلقة بطول ثلاثة ملليمترات. انقل الأجزاء إلى حمام عضو من أربع قنوات سعة 10 ملليلتر محمل بمخزن كريبس المؤكسج.

باستخدام مقبض محول الطاقة ، ضع 1.5 جرام من الادعاء على كل حلقة أورطي. وفقا للنتائج التجريبية. 1.5 جرام هو توتر البداية المناسب لوظيفة الحركية الوعائية المثلى.

في شاشة الماوس وتسجيل قياس القوة باستخدام جسر ثماني القنوات ثماني القنوات وبرنامج الحصول على البيانات ، اسمح للحلقات بالتوازن لمدة 80 دقيقة ، وتغيير المخزن المؤقت كل 20 دقيقة ، ثم تابع التجريب. بعد أن يتوازن توتر الأنسجة ، أضف 100 نانومولار من شمر الشمر إلى كل حلقة لتقلص دون الحد الأقصى. بمجرد استقرار توتر الحلقة ويكون هناك مستوى ثابت من النغمة ، قم بإجراء تحليل استجابة الجرعة لناهض البطاني مثل الأسيتيل كولين.

سيحدد هذا إنتاج أكسيد النيتريك ودرجة استرخاء الأوعية الدموية. بعد استجابة الجرعة للأستيل كولين ، اشطف الحمامات باستخدام مخزن كريبس المؤقت وأضف 100 نانومولار من شمر الشمر إلى كل حمام عضو لتقليص الأوعية. مرة أخرى ، حدد استجابة حلقات العضلات الملساء لمصدر خارجي لأكسيد النيتريك مثل جانب نيتروبريس الصوديوم مع وبدون ODQ ، وهو مثبط لسيكلاز المكر القابل للذوبان.

سيحدد هذا النوع من النهج قيمة استرخاء بنسبة 100٪ للأوعية ويوضح أيضا الطبيعة الأساسية ل cycle cyclae القابلة للذوبان في التوسط في استجابة أكسيد النيتريك لاسترخاء الأوعية الدموية. نظرا لأن ODQ سيمنع الاسترخاء إلى نيترو الصوديوم IDE استجابة للأستيل كولين ، فإن حلقات الأبهر من التحكم الصحي ، استرخت الفئران بينما أظهرت حلقات الأبهر من الفئران المصابة بخلل بطاني انخفاضا في الاسترخاء بسبب انخفاض إنتاج أكسيد النيتريك. كما تم إجراء فحوصات محددة للمجموعة على الضابطة التلألؤ الكيميائي للنتريت.

تم الكشف عن RSNO و RNNO باستخدام مقايسة دي نيتروس المختزلة. بطرح مناطق الذروة ، تم قياس مستويات النتريت و r sn. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أكسيد النيتريك وبيولوجيا الأوعية الدموية ، مثل كيف تعكس المستويات المنتشرة لمستقلبات أكسيد النيتريك مستويات الأنسجة وكيف تتغير مستقلبات المرض في حالات المرض المختلفة؟

سيسمح تحديد تركيزات الحالة المستقرة ونصف عمر مستقلبات أكسيد النيتريك ذات الصلة في أنظمة الأعضاء المتعددة وطوال دوران واحد بتحديد التوقيعات الجزيئية المحددة لعمليات المرض ويساعدنا في تحديد طرق العلاج الجديدة القائمة على أكسيد النيتريك ، والتي ستسمح للطبيب بالتسليح بمؤشرات حيوية أفضل لشدة المرض أو تطوره. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في مجال حمض النيتريك لأن العديد منهم يقلل من الحساسية بما يكفي لاكتشاف وتحديد هذه المستويات المنخفضة من استقلاب حمض التريك الموجودة في العينات البيولوجية. بادئ ذي بدء ، من المحتمل أن تؤدي مهارة واحدة غير مهارة في الفن إلى إنشاء قطع أثرية أثناء معالجة العينة تحتاج إلى بيانات خاطئة وسوء تفسير البيانات.