عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

الهدف من هذه الطريقة هو عزل الخلايا الجذعية من قنوات الغدد تحت المخاطية في الرغامي للفأر لدراسة الإصلاح والتجديد. أولاً، يتم تشريح الرغامي من فأر تم قتله رحيمًا، ثم يتم تنظيف الرغامي وقطعه وهضمه.

بعد ذلك، يتم كشط الظهارة ميكانيكيًا وهضمها بشكل أكبر لإنتاج معلق من الخلايا المفردة. ثم تُصبغ الخلايا لفرزها، وتُعالَج أخيرًا لاستخدامها في المقايسات الحيوية (in vivo) والمقايسات المختبرية (in vitro). وفي النهاية، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في تحديد المسارات الرئيسية التي تنظم التجديد الذاتي والتمايز للخلايا الجذعية الظهارية في الممرات الهوائية.

تعد هذه التقنيات مهمة لأنها توفر لنا نماذج لإصلاح وتجديد الظهارة التنفسية في المختبر (in vitro) وخارج الجسم (ex vivo). وهذا يتيح لنا دراسة عملية الإصلاح الطبيعية للمجاري التنفسية، بالإضافة إلى أمراض الجهاز التنفسي، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن، والتليف الكيسي، والربو. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما لم نتمكن من العثور على علامات سطحية محددة لعزل الخلايا القاعدية عن الخلايا الجذعية القنوية، لذا قررنا إزالة الظهارة السطحية مع الخلايا القاعدية وترك الخلايا القنوية. توضيح إجراءات تشريح الرغامي.

سيتم إجراء عملية تقشير الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية، وتحضير معلق خلوي أحادي، وفرز الخلايا باستخدام تقنية FACT. يقوم باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بالتعاون مع مدير المختبر، باستعراض إجراءات معالجة الخلايا المفروزة في النماذج المختبرية (in vitro) والنماذج المستأصلة (ex vivo). ابدأ هذا الإجراء بفتح جدار البطن لفأر تم القضاء عليه رحيمًا.

حرك الأمعاء إلى الجانب لكشف الشريان الأورطي البطني ثم قم بتشريحه. افتح الصدر عن طريق القطع عبر الحجاب الحاجز وجدار الصدر الداخلي على كلا الجانبين لكشف القلب والرئتين. استمر في القطع صعوداً إلى الرقبة، مع إزالة الدهون والغدد اللعابية لكشف القصبة الهوائية باستخدام مقص دقيق.

قم بإزالة الغدة الزعترية وافصل الرئة عن النسيج الضام الموجود أسفلها وخلفها. بعد ذلك، أدخل الملقط بين الرغامي والمريء لفصلهما. اقطع الرغامي من جزئه العلوي فوق نقطة اتصاله بالحنجرة.

بعد ذلك، أمسك الرغامي بالملقط وافصلها عن موقع اتصالها. واستكمالاً للعملية نحو الأسفل لإزالتها مع كتلة القلب والرئة، قم بقص القلب والرئتين بالقرب من السرة بحيث يتم تضمين معظم الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى واليسرى. ضع الرغامي في طبق بتري صغير يحتوي على وسط تجميع على الثلج تحت مجهر التشريح.

استخدم ملقطاً دقيقاً رقم 5، وملقطاً طبياً، وأنبوباً وريدياً، ومقصاً لإزالة أي أنسجة ملتصقة بالقصبة الهوائية. يشمل ذلك العقد اللمفاوية، ودهون العصب الحنجري الراجع، والغدة الدرقية، والأوعية الرئوية المتبقية. يتطلب الجزء العلوي من القصبة الهوائية عناية خاصة لإزالة القطع الكبيرة من الغضروف الحنجري دون المساس بالتجمع الأكبر من الغدد تحت المخاطية المستقرة بين الغضروف الحلقي (CRICO) وأول حلقة غضروفية قصبية C1.

بعد ذلك، يتم قطع الرغامي إلى جزء علوي وجزء سفلي بين الفقرتين C four وC five، ثم يتم القص. يتم فتح كلا الجزأين عبر تجويف الرغامي. يُنقل الجزء السفلي من الرغامي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1 milliliter، وينقل الجزء العلوي من الرغامي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter من أجل الهضم الإنزيمي والمعالجة لتحويلها إلى معلقات من الخلايا المفردة.

في الجزء التالي من الإجراء، يتم معالجة الجزأين السفلي والعلوي من الرغامى لإنتاج معلقات من الخلايا المفردة. وبينما يجب معالجتهما بالتزامن هنا، سيتم عرض الطريقتين بشكل متسلسل. لمعالجة الجزء السفلي من الرغامى، أضفه إلى 1 mL من 16 unit dis space في أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم قم بتحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ثم انقل الرغامي إلى أنبوب جديد يحتوي على 0.5 mg/mL من DNAse I في وسط DMM لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الهضم، استخدم ملقطاً دقيقاً لنقل النسيج إلى طبق بتري معقم يحتوي على وسط تجميع جديد. ثم، وباستخدام المجهر التشريحي، قم بإزالة الظهارة السطحية عن طريق سحب الصفائح الظهارية برفق لفصلها عن الغشاء القاعدي الموجود تحتها. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل الوسط الذي يحتوي على الظهارة المُزالة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL، ثم قم بالطرد المركزي عند 1000 ×g في درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الـ SNAT وأضف 0.1%tripsin EDTA، ثم حضن الأنبوب في حاضنة هزازة عند درجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد التحضين، استخدم ماصة ذات طرف 1000 microliter للسحب والدفع بشكل متكرر لتفكيك تكتلات الخلايا وضمان تكوين معلق خلوي أحادي. ضع الرغامي العلوية في أنبوب مخروطي يحتوي على واحد milliliter من 0.15%Pronase، ثم حضنها عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة أربع ساعات. انقل الجزء السفلي من الرغامي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة واحد milliliter يحتوي على واحد milliliter من الوسط الذي يحتوي على 16 units من disc base.

بعد الانتهاء من فترة الحضن، قم برج الأنبوب بلطف باستخدام جهاز vortext، ثم ضع الرغامي في وسط تجميع جديد. وتحت مجهر التشريح، تأكد من الانفصال التام للظهارة السطحية. استخدم مقصاً دقيقاً لفرم الرغامي وفتح حجيرات الغدد الموجودة تحت المخاطية.

قم بالتحضين لمدة ساعة إضافية في 0.15% pronase في درجة حرارة الغرفة مع الرج البطيء. قم بطرد أنسجة الرغامي مركزياً بعد إزالة pronase. أضف 0.1% trypsin EDTA وقم بالتحضين عند 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة مع الرج.

بعد ذلك، قم بتصفية الكتل الكبيرة باستخدام مصفاة قياس 70 micron. ثم اغسل المصفاة باستخدام الوسط الغذائي. مرر تجمعات الخلايا المهضومة وأي كتل متبقية من الغدد عبر إبر قياس 20 gauge و 23 gauge و 26 gauge باستخدام حقنة سعة 10 milliliter.

كرر عملية التعبئة عدة مرات باستخدام كل حجم من الإبر قبل الانتقال إلى الحجم الأصغر. الآن، يجب أن تكون معظم الخلايا في معلق خلوي أحادي. قم بتصفية المعلق عبر مصفاة بمسام 40 micron، ثم اغسل المصفاة بالوسط الغذائي وقم بطرد الخلايا مركزياً.

بعد ذلك، أعد تشكيل الخلايا في الحجم المناسب من الوسط، وقم بعدّ الخلايا وانتقل مباشرةً إلى صبغ الخلايا وفرزها. خذ عدداً كافياً من الخلايا لتحضير أنابيب التعويض غير المصبوغة والمصبوغة بصبغة واحدة. ثم اصبغ بقية الخلايا باستخدام أجسام مضادة أولية ضد trop tube و I TGA six لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد فترة الحضانة، اغسل الخلايا باستخدام PBS أو وسط التجميع، ثم تخلص من السائل الطافي بحذر شديد.

قم بتفكيك راسب الخلايا المصبوغ باستخدام الجسم المضاد الثانوي المناسب. يتم التحضين في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم الغسل وإزالة الصبغة ثم تفكيك الراسب.

يمكن الآن فرز الخلايا باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشط بالفلورة. وبعد فرز الخلايا، يمكن استخدامها لاستقصاء آليات الإصلاح والتجدد لإنشاء مستنبتات مكونة للكريات في المختبر. اخلط 100 µL من مادة الماتريجيل (matrigel) المخفضة لعوامل النمو مع 100 µL من الوسط الغذائي الكامل الذي يحتوي على ما يصل إلى 50,000 خلية مفروزة.

انقل هذا الخليط باستخدام الماصة إلى الحجرة العلوية من طبق transwell ذو 24 بئرًا، ثم ضع في الحجرة السفلية 400 µL من الوسط الغذائي الكامل، واحضن الطبق عند 37 °C. قم بتغيير الوسط الغذائي في الحجرة السفلية كل يومين، وأضف 100 µL إضافية من Matrigel أسبوعيًا أو قبل ذلك في حال أصبح الخليط رقيقًا.

تتشكل الكريات عادةً بعد سبعة أيام ويمكن تنميتها لعدة أسابيع أو نقلها تسلسلياً. وبالنسبة للنموذج الحي، أعد تعليق كتلة الخلايا المفروزة في وسط كامل ممزوج بنسبة واحد إلى واحد مع matri gel بتركيز يتراوح من 5, 000 إلى 10, 000 خلية لكل 50 µL. بعد تخدير فأر C 57 black six المستقبل، قم بتعقيم وحلاقة ظهره ثم المنطقة العلوية من الظهر.

أجرِ شقاً جلدياً طولياً مركزياً. استخدم الطرف غير الحاد لشفرة المقص لتوسيع الجيوب بين الجلد والجزء الخلفي من جدار الصدر على كلا الجانبين. ادفع طرف الفأر للأعلى وللخلف لتحريك وتحديد الحافة الإنسية للكتف.

بعد ذلك، باستخدام محقنة إنسولين سعة 300 µL، يتم حقن 50 µL من معلق الخلايا في الوسادة الدهنية في المنطقة الإنسية بالنسبة للكتف والوحشية بالنسبة للفقرات. يجب أن تتشكل فقاعة؛ كرر عملية الحقن على الجانب الآخر، ثم قم بتدبيس أو خياطة شق الجلد. بعد ثلاثة أسابيع، يتم فتح جلد الفأر الذي خضع للقتل الرحيم كما في السابق واستئصال الوسادة الدهنية بأكملها من كلا الجانبين مع ترك هامش أمان.

لتجنب فقدان أي بنية نسيجية قد تكون تشكلت وامتدت حول المنطقة، يتم تثبيت الوسادة الدهنية المُشرحة في PFA ثم طمرها في البارافين لتجنب تخطي أو إغفال البنى النسيجية أثناء عملية تقطيع القوالب. يتم التشذيب لمرة واحدة عند 40 microns، ثم يتم قطع شريحة بسماكة أربعة micron.

ضعها على شريحة زجاجية، ثم افحصها تحت المجهر لتحديد ما إذا كانت البنى الظهارية موجودة. إذا لم يظهر شيء، فقم بالتشذيب مرة أخرى وكرر هذه الخطوة. إن تقشير القصبة الهوائية للفأر كما هو موضح في هذا الفيديو، سيؤدي إلى الحصول على قصبة هوائية مجردة يمكن رؤيتها بالمجهر الضوئي كما هو موضح هنا denuded tracheas.

بعد 30 دقيقة من الهضم باستخدام إنزيم papain، يظهر الهضم على اليسار وفي القصبات الهوائية المجردة. وبعد أربع ساعات من الهضم باستخدام إنزيم pronase يظهر الهضم على اليمين. وبعد إزالة الطبقة الطلائية، تتحرر الغدد تحت المخاطية من الأنسجة وتظهر على شكل عناقيد العنب.

يظهر إزالة الخلايا الظهارية السطحية بالأسهم السوداء. وتظهر إزالة الخلايا في الغدة تحت المخاطية والقنوات بالأسهم الخضراء. يجب أن يظهر قياس التدفق الخلوي لمعلقات الخلايا المفردة مخططات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي كما هو موضح هنا.

فصل جيد لخلايا القنوات عن البقية. إذا كان من المفترض رؤية الخلايا الرغامية باستخدام جسم مضاد Trop two في قياس التدفق الخلوي من أجل فرز الخلايا المنشط فلورياً، فبعد حوالي أسبوع واحد في المزرعة، يجب أن تكون الكريات مرئية في مادة الـ matri gel، وتكون تجويفية عندما تشتق من الخلايا القاعدية، وتكون ذات مظهر قنوي عندما تشتق من خلايا القنوات. تبلغ كفاءة هذه العملية في حدود 1 إلى 2%، وستظل الخلايا المفردة موجودة في الـ matrigel، ومن المرجح أنها تمثل خلايا من قنوات الغدة تحت المخاطية التي لا تملك القدرة على التجدد الذاتي.

تكون الكرات القاعدية أكبر حجماً وذات مظهر تجويفي. ويؤدي حقن الخلايا الجذعية القنوية في الوسادة الدهنية للفأر إلى تكوين تراكيب تشبه الغدد تحت المخاطية، وتكون كروية الشكل وتمتلك تجويفاً مركزياً. ويمكن رؤية هذه التراكيب في القطع النسيجية حتى بدون صبغ الـ h and e.

يجب إجراء العديد من المقاطع العرضية عبر الوسادة الدهنية للحصول على مقطع يحتوي على هذه البنى الظهارية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجتمع من الخلايا الجذعية من خلايا القناة الغدية تحت الفكية، وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون 10 ساعات. وباتباع هذا الإجراء، يمكن تغيير ظروف الزرع من أجل الإجابة على عدة أسئلة مختلفة تتعلق بتكوين الكريات وعوامل نمو تعزيز التجدد.