جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا تائية تنظيمية بشرية من خلايا تائية أولية. أولاً، يتم عزل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي من عينات دم بشرية. ثم يتم تنقية الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 من خليط PBMC وزراعتها.

بعد ستة أيام، يتم فرز الخلايا إلى مجموعات فرعية من الخلايا التائية الذاكرة الساذجة، والجهادية، والخلايا التائية التنظيمية المستحثة باستخدام مقياس تدفق الخلايا، ثم تُجرى اختبارات الكبح. وباستخدام هذه الخلايا، يتم إثبات أن هذه الطريقة تنتج خلايا تائية تنظيمية بشرية ذات نشاط كابح. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بتلك التي تستخدم خلايا الفئران في أن طريقتنا البشرية ذات صلة فسيولوجية وسريرية أكبر، وتسمح بمقارنة الخلايا التائية التنظيمية مع المجموعات الخلوية الأخرى من متبرع واحد.

القضاء على التباين الداخلي بين الخاضعين للدراسة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية حول المجال الخلوي التنظيمي، مثل ما هي الأحداث التنظيمية التي تعدل الانتقال بين الخلايا التائية التقليدية والخلايا التنظيمية، أو ما هي أحداث التأشير والنسخ النوعية في الخلايا التنظيمية؟ وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاجات أمراض المناعة الذاتية، وحالات الالتهاب، والسرطان، نظراً للدور الحيوي الذي تؤديه الخلايا التنظيمية في التوازن المناعي.

بشكل عام، يواجه الأشخاص الجدد صعوبة في هذا الجانب التقني نظراً لتنوع التقنيات المستخدمة، وفي بعض الخطوات، بسبب النطاق الضيق لظروف زراعة الخلايا المثالية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تطور Reg، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لمراقبة لدنّية تمايز سلالة الخلايا التائية (T-cell) أو لتحليل قدرة milli use للخلايا التائية على تحفيزه أو منعه. ستقوم Andrea McCool وطلاب الدراسات العليا Marie Catherine Ranier وGavin Ellis وCatalina Vale Ortega بشرح إجراء تطور Reg.

ابدأ هذا الإجراء بفصل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي البشري من 40 إلى 60 لتر من الطبقة الكريمية (Buffy coat). ولتخفيف الطبقة الكريمية، انقلها إلى زجاجة أوتوكلاف سعة 500 ملليلتر تحتوي على 150 ملليلتر من محلول PBS المعقم. ثم أضف المزيد من محلول PBS المعقم لرفع الحجم النهائي إلى 250 ملليلتر. بعد ذلك، املأ 10 أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر، بحيث يحتوي كل أنبوب على 20 ملليلتر من محلول lympho prep.

بعد ذلك، قم بإضافة 25 ملليلتر من الطبقة الكريمية المخففة برفق فوق محلول Lympho prep، مع الحرص على عدم تحريك محلول Lympho prep. قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة عند 500 ×g. تأكد من إيقاف تشغيل مكبح جهاز الطرد المركزي لتجنب زعزعة جزء الخلايا اللمفاوية.

بعد عملية الطرد المركزي، ستكون خلايا PBM CS عند الواجهة الفاصلة بين طبقة التحضير اللمفاوي وطبقة وسط البلازما لجمعها. قم بسحب وسط البلازما حتى يتبقى حوالي 1 mL يغطي طبقة الغشاء الكريمي (buffy coat) التي تحتوي على pbmc. استخدم ماصة سعة 10 mL لنقل pbmc إلى أنبوب جديد سعة 50 mL.

بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS، أعد تعليقها في 50 milliliters من RPMI البارد وقم بعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). يكون الاسترداد النموذجي من 8 × 10⁸ إلى 1 × 10⁹ من p BMCs بعد تحديد التركيز. أعد تعليق PBM CS بتركيز نهائي قدره 5 × 10⁷ لكل milliliter في PBS يحتوي على 2% FBS و1 millimolar EDTA، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين جديد ذو قاع مستدير سعة 14 milliliter.

بعد ذلك، سيتم استخدام مجموعة EAs لاختيار الخلايا المستهدفة عن طريق الاستبعاد السلبي. تحتوي كوكتيلات إثراء الخلايا التائية المرفقة مع المجموعة على معقد أجسام مضادة رباعي القسيمات، والذي يحتوي على جسم مضاد للدكسترين من جهة، وجسم مضاد ضد مستضدات سطح الخلية غير المرغوب فيها من الجهة الأخرى. وعند إضافة الكوكتيل إلى الخلايا، يقوم معقد الأجسام المضادة رباعي القسيمات بربط الخلايا غير المرغوب فيها.

تُضاف بعد ذلك جسيمات مغناطيسية مغلفة بالدextran، والتي ترتبط بمعقد الأجسام المضادة الرباعي، مما يربط الخلية غير المرغوب فيها بالجسيم المغناطيسي. ثم يُستخدم مغناطيس لفصل الخلايا غير المرغوب فيها عن الخلايا المستهدفة، والتي تُجمع لاحقاً لعزل خلايا T الإيجابية لـ CD4. قم بنقل 1×10⁸ إلى 4.25×10⁸ من pbmc إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. ثم أضف 50 µL من كوكتيل إثراء الأجسام المضادة لخلايا T البشرية الإيجابية لـ CD4 لكل milliliter من pbmc.

امزج وحضن المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. امزج الجسيمات المغناطيسية لتوزيعها بالتساوي في جميع أنحاء المحلول. أضف 100 µL من الجسيمات المغناطيسية لكل 1 mL من pbmc.

امزج المحلول عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة من مرتين إلى ثلاث مرات، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف محلول PBS المحتوي على FBS وEDTA لرفع الحجم إلى 10 milliliters لكل أنبوب، مع المزج عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة من مرتين إلى ثلاث مرات. بعد ذلك، ضع الأنبوب غير مغطى في المغناطيس cept لمدة خمس دقائق مع إبقاء الأنبوب داخل المغناطيس.

صب السائل في أنبوب جديد سعة 50 milliliter لعزل الخلايا المستهدفة لضمان استعادتها بشكل أفضل. كرر هذه العملية بإضافة المزيد من P-B-S-F-B-S-E-D-T-A إلى الأنبوب مع الخلط ثم وضع العينة مرة أخرى في المغناطيس. بمجرد عزل الخلايا، قم بتعدادها ثم قم بطردها مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط الاستقطاب للوصول إلى تركيز 2 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر. ثم انتقل إلى الزراعة كما هو موضح في القسم التالي من الفيديو لتحفيز الخلايا التائية التنظيمية. قم بتدفئة أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار المطلية بـ anti CD3 مسبقاً عند 37 °C.

بمجرد أن تدفأ الأطباق، قم بشفط PBS من الآبار. ثم أضف أربعة مليليترات من معلق الخلايا المخصبة إيجابياً CD four إلى كل بئر. املأ أي آبار فارغة بـ PBS لتقليل تبخر الوسط، ثم قم بالتحضين لمدة ثلاثة أيام بعد عملية التحضين.

قم بطرد الطبق مركزياً لمدة خمس دقائق عند 500 ×g. بعد ذلك، ودون تعكير الخلايا الموجودة في قاع الطبق، قم بإزالة نصف الوسط واستبداله بوسط جديد ثم حضنها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام إضافية. يمكن الآن فرز الخلايا عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورية كما هو موضح في القسم التالي، أو استخدامها كخلايا مستهدفة في مقايسة تثبيط كما هو موضح لاحقاً، وبعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام، يتم تحضير الخلايا وضوابط التعويض المناسبة لفرز الخلايا المنشط بالفلورية. لفرز وفصل الخلايا التائية التنظيمية المحفزة والساذجة والخلايا التائية الذاكرة، قم بصبغ الخلايا المراد فرزها باستخدام anti CD 25 pe و anti CD 45 RA PE SCI five و anti CD 1 27 A PC كما هو موضح في الوثيقة المرفقة.

تأكد أيضاً من إضافة الأجسام المضادة إلى عناصر تحكم التعويض المناسبة لتحليل FACS. بعد التلوين، أعد تعليق الخلايا بتركيز 1×10⁷ خلية/مل في محلول الغسيل المنظم، ثم أضف 1.5 µL من DNAse لكل مل من الخلايا، وقم بترشيح الخلايا عبر مصفاة خلوية نايلون بمسام 40 micron. انقل الخلايا إلى أنابيب بولي بروبيلين ذات قاع مستدير سعة 5 مل بحيث لا يتجاوز حجم السائل 3.5 مل لكل أنبوب.

أعد تعليق خلايا التحكم في التعويض في 300 µL من محلول الغسيل المنظم. اضبط التعويض في جهاز قياس التدفق الخلوي لتقليل الكشف المتقاطع بواسطة مرشحات PE A PC و PE sci-fi. حدد البوابات لفرز خلايا tregs وخلايا T الساذجة وخلايا T الذاكرة في أنابيب بوليسترين مستديرة القاع سعة خمسة مل تحتوي على 1 mL من مصل العجل حديث الولادة، وذلك لتقييم ما إذا كانت الخلايا التائية التنظيمية الناتجة عن عملية الفرز قادرة على تثبيط تكاثر الخلايا التائية.

يتم هنا إجراء مقايسة تثبيط. ستعمل الخلايا المثرية الإيجابية لـ CD4 غير المصنفة كخلايا مستهدفة. ويجب ألا تحتوي هذه الخلايا على خلايا تائية تنظيمية محثثة إيجابية لـ CD25.

ابدأ بتمييز الخلايا المستهدفة باستخدام CFSE بواسطة طقم تتبع الخلايا وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، مع استخدام 1 µL من المحلول المخزون بتركيز 5 M لكل مللي لتر من الخلايا بدلاً من 2 µL. بعد ذلك، قم بترسيب عدد من حبيبات فحص تثبيط Treg يساوي العدد الإجمالي للخلايا عن طريق الطرد المركزي السريع في أنبوب طرد مركزي دقيق. اغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام RPMI وأعد ترسيبها بعد عملية الطرد المركزي.

قم بشفط وسط RPMI وإعادة تعليق الخلايا بالتركيز المناسب في ثمانية ميكرولتر من وسط مقايسة الكبح (suppression assay medium) لكل بئر في طبق زراعة أنسجة ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئرًا. أضف ثمانية ميكرولتر من الخلايا المستهدفة المصبوغة بـ CFSE. افحص الخرز والخلايا المصنفة المستقطبة للوصول إلى الحجم النهائي من وسط مقايسة الكبح الطازج.

وسط بمقدار 200 µL. يتم توزيع جميع الظروف في ثلاث مكررات. لتحضير الضوابط، أضف 100 µL من الخلايا المصبوغة بـ CFSE، وثمانية µL من خرزات الفحص (inspector beads)، و1×10⁵ من الخلايا الطازجة غير المصبوغة في 92 µL من مقايسة الكبح (suppressor assay).

أضف الوسط إلى أول بئرين من آبار التحكم. ثم أضف 100 µL من الخلايا المصبوغة بـ CFSE و 1×10⁵ من الخلايا الطازجة غير المصبوغة في 92 µL من وسط مقايسة الكابت. أضف الوسط إلى البئرين الثانيين من آبار التحكم.

قم بتغطية الطبق بورق الألومنيوم وضعه في الحاضنة لمدة خمسة أيام في الظلام. اجمع الخلايا من كل بئر باستخدام الماصة وضعها في أنبوب بولي ستيرين مستدير القاعدة سعة 5 mL. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

قم بشفط الوسط ثم أعد تعليق الخلايا في 300 µL من منظم غسيل fACS البارد. لمراقبة تقدم تمايز الخلايا التائية التنظيمية المستحثة، تم زراعة خلايا تائية أولية بشرية منقاة CD4+ و CD25- في وسط iTreg؛ حيث تم أخذ عينات في الأيام 0 و1 و3 و5 وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي لتقييم تعبير واسمات CD45RA و FoxP3 و CTLA4 و CD25. وكما يظهر في مخططات النقاط ذات الألوان الزائفة هذه، تتكاثر الخلايا وتتمايز في المختبر استجابةً للربط المتقاطع لـ CD3 في وجود TGF-β و IL-2، مما يؤدي في النهاية إلى ظهور نمط CD45RA- و FoxP3 high و CTLA4 high و CD25 high. يشير هذا إلى تطور الخلايا التائية التنظيمية المستحثة (iTregs) من سلائف الخلايا التائية التقليدية. ولتقييم القدرة النسبية للخلايا التائية التنظيمية الناتجة على تثبيط تكاثر الخلايا التائية.

تم استزراع الخلايا الموصومة بـ CFSE مع خرزات فاحص تثبيط treg في وجود خلايا naive memory و i treg المفرزة كما يظهر في هذا المدرج التكراري. الخلايا ذات التعبير العالي لـ CD 25، والسالبة لـ CD 45 RA والسالبة لـ CD 1 27. تعتبر الخلايا التائية التنظيمية المستحثة المنخفضة هي المجموعة الفرعية الوحيدة من استزراع استمر لخمسة أيام والتي اكتسبت قدرة تثبيط تنظيمية.

يشير هذا إلى أن الخلايا الناتجة في هذا النظام هي خلايا تائية تنظيمية كابحة من الناحيتين المظهرية والوظيفية، وليست خلايا تائية تقليدية منشطة، والتي قد تعبر بشكل عابر عن FOX P3 و CD 25، ولكنها ليست مثبطة للمناعة. إن وجود الخلايا التائية التنظيمية المستحثة يلغي تماماً تكاثر الخلايا التائية الموجبة لـ CD 4. وتشير الأرقام إلى النسبة المئوية للخلايا الملحقة بـ CFSC التي خضعت للانقسام لتحديد ما إذا كان الأمر ذاته ينطبق على المجموعات الفرعية المنقاة من الخلايا التائية.

صُبغت الخلايا التائية البشرية الأولية الساذجة والخلايا التائية الذاكرة بـ CFSE وزُرعت في وسط Treg. وبعد خمسة أيام، تم تحديد النمط الظاهري للخلايا وتقدير معدلات انقسام الخلايا كما هو موضح. هنا، تم تحفيز الخلايا التائية التنظيمية (tregs) من مجموعة من الخلايا التائية الساذجة ومجموعة من الخلايا التائية الذاكرة بعد زراعة استمرت خمسة أيام.

في وسط زراعة الخلايا التائية التنظيمية القياسي (IT reg medium)، يظهر تلوين CFSE للخلايا الأولية أن الخلايا التائية الساذجة أو الذاكرة تتمايز إلى خلايا تائية تنظيمية فقط بعد عدة جولات من انقسام الخلايا. وتحدد ملفات تلوين CFSE المقارنة الخلايا التائية التنظيمية المستحثة على أنها الخلايا الأكثر تكاثراً خلال فترة الزرع التي تستمر لخمسة أيام. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على خلايا TX المستحثة من مجموعة من الخلايا التائية الساذجة أو الذاكرة أو خلايا تائية كاملة تم الحصول عليها من متبرع واحد أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء.

من المهم الحفاظ على التقنية المعقمة طوال الوقت ومنع تعرض CFSE للضوء بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المقايسات الوظيفية للإجابة على تساؤلات أخرى، مثل ما هي الاختلافات في معدلات انقسام الخلايا، وتخليق السيتوكينات المحددة، واستخدام القنوات الأيونية بين الخلايا التائية التنظيمية والخلايا التائية التقليدية بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف أمراض المناعة الذاتية وغيرها من الحالات المرضية المتعلقة بـ treg لدى المرضى البشر.

لا تنسَ أن التعامل مع الدم البشري ينطوي على مخاطر شديدة، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل إجراء فحوصات بنك الدم الكافية والتخلص السليم من العينات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.