الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

يعد تحليل تفاعلات COMIN باستخدام تسلسل المسحوق والعلامات (powder and tag sequencing) طريقة لتحليل تفاعلات COMIN طويلة المدى على مستوى الجينوم بالكامل. وبإيجاز، نطلق على هذه الطريقة اسم magic share pad. تتضمن هذه الطريقة العديد من خطوات البيولوجيا الجزيئية وقد تكون معقدة.

لذلك، سنعرض لكم في مقطع الفيديو التالي بعض الخطوات الرئيسية المتبعة في عملية الترسيب المناعي للكروماتين، وبناء المكتبة الخاصة بتحليل ChIA-PET. يُعد الترسيب المناعي للكروماتين، والمعروف باسم ChIP، الخطوة الحاسمة الأولى في بناء مكتبة ChIA-PET؛ حيث يتم هنا ربط عينات الكروماتين من المزارع الخلوية عرضياً، ثم تعريضها للموجات فوق الصوتية، تليها عملية الترسيب المناعي.

يتم بعد ذلك ربط حصص منفصلة من الحمض النووي (DNA) للرقاقة بوصلات نصفية مرمزة، ثم يتم إجراء ربط التقارب. وتُحرر القطع عن طريق الهضم التقييدي، وتُنقى باستخدام حبيبات مغناطيسية مغلفة، ثم تُربط بموائمات لتسلسل الجيل القادم. ويتم التعرف على القطع الوهمية (chimeric) من خلال تركيب الوصلة AB وتحديد العلامات المجاورة.

يتم قراءة تسلسل الرابط المركزي ورسم خرائطه على الجينوم. في هذا الفيديو، سنعرض بروتوكول ChIP القياسي المستخدم بشكل روتيني في مختبرنا على خط خلايا سرطان الثدي MCF7. تشير بياناتنا إلى أن زيادة إثراء ChIP باستخدام أجسام مضادة محددة تؤدي إلى الحصول على بيانات ChIP-seq أفضل. لذا، نوصي بشدة بتحسين بروتوكول ChIP والتحقق من الإثراء عن طريق QPCR.

قبل البدء في بناء مكتبة CRISPR، يتم استزراع خلايا CF7 حتى تصل درجة التلاقي إلى حوالي 75% في طبق زراعة أنسجة بمساحة 500 cm²، والذي يحتوي على 20 مليون خلية تقريبًا قبل عملية الربط التشابكي. يتم التخلص من وسط النمو وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS دافئ. تُثبت الخلايا باستخدام 1.5 mM من EGS المحضر حديثًا لمدة 45 دقيقة على جهاز تدوير في درجة حرارة الغرفة. يُضاف formaldehyde بنسبة 37% ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1%، ثم تُحضن الخلايا لمدة 20 دقيقة.

تعد كفاءة الربط التشابكي أمراً بالغ الأهمية وتتفاوت بتفاوت الخطوط الخلوية والبروتين المستهدف. لذا، يجب تحسين كل من تركيز مادة الربط التشابكي، ووقت التحضين، ودرجة الحرارة. يتم إيقاف تفاعل عوامل الربط التشابكي بإضافة glycine بتركيز نهائي قدره 200 millimolar لمدة 10 Minutes.

تخلص من عوامل الربط المطفأة واغسل مرتين باستخدام PBS بارد. قم بتعليق الخلايا عن طريق كشط كريات الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي مبرد، وبذلك تصبح الكريات جاهزة الآن لتحلل الخلايا. بدلاً من ذلك، يمكن تجميد الكريات عند درجة حرارة -80 °C. في حال كانت كريات الخلايا مجمدة، يتم إذابتها على الثلج قبل البدء في عملية تحلل الخلايا، ثم تُعيد تعليق الكريات باستخدام Buffer تحلل الخلايا SDS بتركيز 0.1%.

قم بتدوير الأنبوب عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد، ثم تخلص من السائل الطافي وكرر عملية تحلل الخلايا. يتم إجراء التحلل النووي لتحرير الكروماتين المترابط قبل البدء في تفتيت الكروماتين. حيث يتيح غياب الغشاء النووي إمكانية تعريض الكروماتين المترابط للموجات فوق الصوتية في ظل ظروف أكثر اعتدالاً.

أعد تعليق الراسب النووي في محلول تحلل SDS بتركيز 1%. انقُل المعلق إلى أنبوب طرد مركزي عالي السرعة. قم بتدوير الأنبوب عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

قم بإزالة الحطام النووي عن طريق الطرد المركزي. يجب أن تبدو اللوحة اللونية بهذا الشكل. استخدم رأس ماصة P 1000 لتفتيت اللوحة إلى قطع واغسلها مرتين باستخدام محلول غسيل SDS بتركيز 0.1%.

قم بتدوير الأنبوب عند درجة حرارة 4 °C باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد. أصبح الراسب النووي الآن جاهزاً لعملية السونيكاسيون (التفتيت بالموجات فوق الصوتية). بدلاً من ذلك، يمكن تجميد الراسب عند درجة حرارة -80 °C.

انقل العينة إلى أنبوب شفاف. أضف محلول التحلل SDS بتركيز 0.1% إلى العينة وقم بإزالة جميع الفقاعات. حافظ على برودة العينات طوال عملية الموجات فوق الصوتية لمنع ارتفاع درجة الحرارة. يمكن أن تؤثر ظروف مختلفة، مثل حجم المحلول المنظم، وعمق المسبار، وقوة الموجات فوق الصوتية، وعدد الدورات، ومدى التشابك، على كفاءة عملية الموجات فوق الصوتية.

قم بعكس الارتباط التشابكي وتجزئة الكروماتين باستخدام البروتينيز K، ثم قم بتشغيل هلام agarose. وللتحقق من كفاءة التجزئة، يُوصى بإجراء تحسين للحصول على نطاق الحجم المطلوب للحمض النووي DNA بين 200 إلى 600 زوج قاعدي، مع إزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أصبح الكروماتين الآن جاهزاً لعملية التصفية المسبقة باستخدام الخرزات المغناطيسية. وبدلاً من ذلك، يمكن إيقاف العملية عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يتم جمع كمية كافية من الكروماتين. لبدء تقنية ChIP، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام محلول غسل الخرزات؛ وتتكون هذه الغسلات، وكذلك الغسلات المستقبلية التي تتضمن خرزات البروتين المغناطيسية، من الخطوات التالية.

أضف الكروماتين الذي تم تعريضه للموجات فوق الصوتية إلى الحبيبات المغسولة مسبقاً واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في أنبوب منفصل. قم بتغطية الحبيبات المغسولة مسبقاً بالأجسام المضادة واحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الحبيبات المغطاة بالأجسام المضادة مرتين باستخدام محلول غسيل الحبيبات.

تؤدي التعقيد العالي لمادة الركيزة في عملية الربط التقاربي حتماً إلى ضوضاء غير محددة وكبيرة، مما يزيد من تكلفة التسلسل. وبالإضافة إلى تقليل مستوى التعقيد وضوضاء الخلفية، استخدمنا جسماً مضاداً أحادي النسيلة لإنزيم بلمرة الحمض النووي الريبي الثاني في الفئران لتحديد تفاعلات الكروماتين المشاركة في تنظيم النسخ.

يتيح ذلك استقصاء المحفزات النشطة ومناطقها التنظيمية المقابلة، مما يسمح بفهم عملية النسخ الفعالة والتي قد تكون تعاونية. تخلص من محلول الغسل الخاص بالخرزات المغلفة بالأجسام المضادة، ثم ادمج الكروماتين المصفى مسبقاً مع الخرزات المغلفة بالأجسام المضادة واحضن المزيج طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد الحضن الليلي، تخضع الخرزات لسلسلة من عمليات الغسل لإزالة الكروماتين غير المرتبط، ثم يتم تعليق الخرزات في محلول TE buffer. يتم أخذ كمية صغيرة لإجراء فحص كمي وتحقق من الإثراء. يعتبر تحليل تفاعل الكروماتين باستخدام تسلسل pad and tag تقنية طُورت من أجل التحليل الشامل والبدئي (de novo) لبنى الكروماتين ذات الرتب العليا والمتفاعلة.

يتم التقاط قطع DNA التي تم إثراؤها بواسطة الترسيب المناعي للكروماتين عن طريق الربط التقاربي. تُطبق استراتيجية الـ pad and tag في بناء مكتبات CHI PET، والتي يتم تسلسلها باستخدام تقنيات تسلسل الجيل التالي عالية الإنتاجية. سنعرض في هذا الفيديو الجوانب التجريبية الحرجة في بناء مكتبة CHI PET.

يتضمن النصف الأول من بناء المكتبة التعامل مع حبيبات البروتين A أو G، التي ترتبط بها قطع DNA، لإزالة الإنزيمات وملح التخزين المؤقت. بعد كل تفاعل إنزيمي، استخدم عملية طرد مركزي خفيفة وعملية نقر لكل خطوة غسيل. اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة عدة مرات لزيادة قدرة التقاط الحبيبات عند وضعها على جسيم مغناطيسي.

جهاز تركيز لجميع خطوات الحضانة التي تحتوي على حبيبات في خليط التفاعل. قم بتحضير الخليط الرئيسي مسبقاً وأضف الإنزيم في النهاية بعد إعادة تعليق الحبيبات بشكل متجانس. تأكد من خلط الحبيبات جيداً طوال فترة الحضانة بالكامل. صُممت قليلات النوكليوتيد الرابطة النصفية بترميز شريطي داخلي يتكون من أربع نوكليوتيدات وموقع تعرف لإنزيم القطع من النوع الثاني MME one.

بعد ربط الروابط النصفية بقطع DNA المثبتة في معقدات C الكروماتينية، ستتصل قطع DNA المتفاعلة بتسلسل رابط كامل. تولد هذه الروابط النصفية تسلسلات ذات روابط ab ثنائية مختلفة (heterodimer) مشتقة من نواتج ربط غير محددة، أو تسلسلات ذات روابط AA أو BB ثنائية متجانسة (homodimer) مشتقة من نواتج ربط محددة. وبناءً على ذلك، فإن استخدام رابطين نصفيين بباركودات نوكليوتيدية مختلفة يسمح بتحديد التجارب أو المكررات المختلفة، بالإضافة إلى مراقبة معدلات الربط الخيمري غير المحدد بين معقدات الرقائق المختلفة.

من المهم تحضير التفاعل على الثلج وإذابة الروابط النصفية (half linkers) برفق على الثلج. امزج الروابط النصفية جيداً مع الماء، ثم مع محلول PEG الذي يحتوي على منظم الليغاز (ligase buffer). تأكد من مزج الخليط الرئيسي (master mix) جيداً قبل إعادة التعليق.

أضف إنزيم T4 DNA ligase إلى الحمض النووي (DNA) المثبّت على الشريحة فقط بعد خلط الروابط النصفية (half linkers) وقطع الـ DNA المثبتة على الشريحة جيداً لمنع تسلسل الروابط النصفية (concatenation). أغلق الأنبوب بإحكام، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند 16 °C مع التدوير. بعد ذلك، يتم شطف معقدات الكروماتين السليمة من الخرزات عن طريق إضافة SDS في منظم EB، ثم يتم إضافة Triton X 100 لتقليل تركيز SDS وإخماد مفعوله. يتم تسهيل دائرية معقدات الكروماتين من خلال ربط رابطين نصفيين، مما يؤدي إلى تكوين تسلسل رابط كامل عند نقطة التفاعل. قم بربط معقدات الكروماتين المستخلصة في ظروف مخففة للغاية لتقليل عمليات الربط بين معقدات البروتين والـ DNA المختلفة، وذلك بإضافة T4 DNA ligase فقط بعد تخفيف معقدات الكروماتين المستخلصة جيداً في خليط التفاعل. بعد عكس الربط التشابكي، ولإزالة البروتينات المرتبطة بالـ DNA، قم بتنقية قطع الـ DNA الدائرية باستخدام استخلاص الفينول والكلوروفورم. استخدم نظام KaiGen phase lock gel لسهولة الفصل.

بعد الاستخلاص بالفينول، استخدم حامل DNA من نوع glyco blue A لزيادة كتلة ووضوح الراسب. تحتوي نصفات النيوكليوتيدات قليلة القسيمات الرابطة (linker oligo nucleotides) على مواقع تعرف MM E one محيطة. يقوم إنزيم التقييد من النوع الثاني MM E one A بقطع 18 و 20 زوجاً قاعدياً في اتجاه المصب من مواقع الارتباط المستهدفة لإنتاج علامات قصيرة لقطعة الكروماتين، مما ينتج عنه بنى رابطة لعلامات PET يُرمز لها اختصاراً بـ pets.

بالإضافة إلى ذلك، يتم تعديل كل نصف رابط باستخدام البيوتين لتمكين تنقية بنى pet بواسطة حبيبات مغناطيسية مغلفة بالستريبتاديفين. قم بإجراء عملية هضم MME واحدة لتحرير بنى الرابط المسمى. قم بتنقية بنى pet من خلال الربط الانتقائي بحبيبات الستريبتاديفين، ثم قم بربط بنى pet مع المحولات لإجراء التسلسل عالي الإنتاجية.

استخدم إنزيم DNA polymerase الاندماجي لتضخيم اندماج مكتبة CHI PET. يُستخدم إنزيم DNA polymerase لإنتاج القوالب بدقة وكفاءة عاليتين. قم بإعداد تفاعل PCR في ظروف باردة وأضف إنزيم DNA polymerase الاندماجي في النهاية.

بما أن الإنزيم يُظهر نشاط نيوكلياز خارجي من النهاية 3' إلى النهاية 5' يمكنه تفكيك البادئات في غياب dNTPs. فإذا تم بناء مكتبة CRISPR بنجاح، يجب أن يظهر نطاق بارز ومحدد بوضوح يبلغ طوله حوالي 223 زوجاً قاعدياً. تجنب النطاقات غير النوعية عند استئصال النطاق الذي يبلغ 223 زوجاً قاعدياً من الهلام، ثم قم بتنقية النطاق المستأصل باستخدام بروتوكول Gel Crush.

قم بإجراء فحص للجودة باستخدام جهاز Agilent 2, 100 bioanalyzer مع طقم DNA 1000 قبل إجراء التسلسل عالي الإنتاجية. لقد قمنا للتو بشرح إجراء CHI PET للكشف غير المنحاز عن تفاعلات الكروماتين على مستوى الجينوم. تعتمد جودة بيانات CHI PET على فعالية الجسم المضاد المستخدم في الرقاقة وعمق التسلسل.

نستخدم هنا من 18 إلى 20 مليون قراءة لرسم خرائط التفاعلات. لقد استُخدم هذا البروتوكول المحدد بنجاح لتوصيف شبكات تفاعلات الكروماتين المرتبطة بمستقبل الإستروجين وبوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) في الجينوم البشري. ونتوقع أن يكون هذا المقايسة أداة قوية للدراسات المستقبلية حول البنية ثلاثية الأبعاد لبيولوجيا النسخ في سياق الجينوم الكامل.

نأمل أن يكون هذا الفيديو مفيداً لكم. شكراً للمشاهدة.I.