إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن أجنة أسماك الزرد ببكتيريا الفلورسنت للتصوير الحي للتفاعل مع الخلايا المناعية المضيفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير وإبرة الحقن أولا وتحميلها بمعلقات بكتيرية. بعد ذلك ، يتم تنظيم الأجنة ومحاذاتها على لوحة الحقن.

ثم يتم حقن اللقاح البكتيري باستخدام طريق لتحقيق عدوى بكتيرية موضعية أو جهازية. أخيرا ، يتم تركيب الأجنة وتصوير الأجنة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر توطين داخل الخلايا لمسببات الأمراض البكتيرية داخل الخلايا البلعمية الفلورية للمضيف الجنيني الشفاف لسمكة الزرد من خلال التألق والفحص المجهري متحد البؤر.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة لأن نموذج جنين الزرد قوي جدا لتصوير الحياة لتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة ، بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب الكثير من الممارسة لحقن البكتيريا الدقيقة بشكل متكرر في الدورة الدموية لأجنة أسماك الزرد للعدوى الجهازية أو في مقصورات محددة لتحقيق العدوى المحلية. بعد سحب الإبر الشعرية الدقيقة الزجاجية وشطف الأطراف بزاوية 45 درجة ، قم بوضع أجنة أسماك الحمار الوحشي بعد 28 ساعة من الإخصاب عن طريق التحقق من الدورة الدموية المتسقة. بداية التصبغ في العين والذيل المستقيم ووضع القلب بطنيا للعين.

بمجرد تخدير الأجنة ، استخدم طرف محمل صغير لتحميل الإبرة بلقاح بكتيري معد مسبقا. قم بتركيب الإبرة المحملة على مناور دقيق متصل بحامل وضعه تحت مجهر استريو. اضبط وقت الحقن على 0.2 ثانية وضغط التعويض على 15 هيكتور باسكال.

اضبط ضغط الحقن بين 700 و 900 هكتور باسكال للحصول على حجم الحقن الصحيح للإبرة المستخدمة. اضبط المناور الصغير بالإبرة المحملة في الموضع الصحيح قبل الحقن. ضع الأجنة المخدرة على طبق حقن مسطح بنسبة 1٪ من الاغاروز وقم بإزالة أي ماء بيض زائد.

بعد ذلك ، استخدم أداة حلقة الشعر لمحاذاة الأجنة لكل حقنة. حرك الصفيحة يدويا أثناء الحقن لتوجيه الأجنة مع توجيه ذيولها نحو طرف الإبرة. ضع طرف الإبرة مباشرة فوق الوريد المدلل بالقرب من فتحة الجهاز البولي التناسلي.

اخترق محيط الجلد بطرف الإبرة وحقن الجرعة المطلوبة من البكتيريا المصنفة بالفلورسنت. نستخدم ما يقرب من 250 وحدات تشكيل مستعمرة أو CFUs من السالمونيلا التيفيموريوم وحوالي 120 CFUs من المتفطرة الماروم. سيتبع المعلق البكتيري المحقون تدفق الدم عبر الوريد المدلل باتجاه جهاز مراقبة القلب إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح عن طريق التحقق من حجم الجهاز الوعائي الموسع مباشرة بعد النبض.

تحقق بشكل متكرر من بقاء حجم الحقن كما هو أثناء التجربة. لتوفير التحكم في اتساق الحقن طوال التجربة ، قم بحقن قطرة من البكتيريا مباشرة على قطرة من PBS المعقم على وسط نمو البكتيريا. بعد كل حقنة جنين 30 تقريبا ، قم بإخراج هذه القطرة وعد المستعمرات البكتيرية بعد الحضانة.

لتحديد CFU في حجم الحقن ، استخدم مجهر ستيريو فلوري لمراقبة خلايا الستايريا الفلورية الفردية المنتشرة في مجرى الدم مباشرة بعد الحقن والتخلص من الأجنة التي لم يتم حقنها بشكل صحيح. يجب أن تكون المجاميع الفلورية لبكتيريا M marum مرئية بعد يومين من الإصابة وتنمو بشكل أكبر بمرور الوقت. للحقن في قناة cuvier ، اصطف التخدير لمدة يومين إلى ثلاثة أيام بعد الإخصاب.

أما بالنسبة لحقن الوريد المدلل بزاوية 45 درجة من الجانب الظهري للجنين ، أدخل الإبرة في نقطة البداية لقناة cuvier. فقط الظهرية إلى الموقع الذي تبدأ فيه القناة في التوسع فوق كيس صفار البيض لموضع حقن البطين الخلفي في الدماغ. تخدير الأجنة بعد 32 ساعة من الإخصاب بجانبها الظهري باتجاه طرف الإبرة.

أدخل الإبرة في البطين الخلفي للدماغ من وضع أمامي دون لمس الهيليوم العصبي للحقن في عضلات الذيل. وضع مخدر بعد يوم إلى يومين من الإخصاب الأجنة مع ذيلها موجه نحو طرف الإبرة ومع الإبرة بزاوية 65 درجة تقريبا ، حقن في العضلات فوق فتحة الجهاز البولي التناسلي لحقن الحويصلة الأذنية. قم بتخدير الأجنة بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الإخصاب مع توجيه ذيول نحو الإبرة.

حقن بزاوية 65 درجة وبضغط منخفض للحقن في سلك العقدة باستخدام يوم إلى يومين. أجنة ما بعد الإخصاب مع الذيل مشيرا بعيدا عن الإبرة. أدخل الإبرة من خلال أنسجة عضلة الذيل في الحبل.

لحقن صفار البيض من 16 إلى 1000 خلية الأجنة تخترق الإبرة من خلال القرنب في وسط صفار البيض لتصوير العدوى. قم بتخدير الأجنة المصابة في طبق بتري ذو طبقات 1٪ مغطى بماء البيض الذي يحتوي على التراكا. باستخدام أداة حلقة الشعر ، قم بمحاذاة الأجنة في الموضع الصحيح للتصوير تحت مجهر ستيريو فلورسنت.

يمكن ملاحظة الخلايا الفلورية الفردية التي تنتشر في مجرى الدم مباشرة بعد الحقن. إذا كان موضع مختلف عن العرض الجانبي مطلوبا. قم بتركيب الأجنة في 1.5٪ ميثيل السليلوز واستخدم أداة حلقة الشعر لمعالجة الجنين في الموضع المطلوب لتصوير العدوى باستخدام مجهر متحد البؤر المقلوب.

ضع قطرة من نقطة الانصهار المنخفضة على طبق زجاجي القاع. ضع الجنين المخدر في القطرة الهوائية بكمية محدودة من ماء البيض واستخدم أداة حلقة الشعر لمعالجة الجنين في موضعه. دع الهواء يصلب ويغمر القطرة الهوائية في ماء البيض الذي يحتوي على تريكا.

العينة جاهزة الآن لحقن التصوير متحد البؤر لبكتيريا السالمونيلا التيفيموريوم أو المتفطرة في جزيرة الدم للأجنة في يوم واحد. ينتج عن ما بعد الإخصاب البلعمة السريعة عن طريق نشر البلاعم ل DS الفلوري الكبير نسبيا واللامع. يمكن تصوير بكتيريا الستايرية ذات العلامات الحمراء مباشرة باستخدام مضان استريو وتصوير متحد البؤر في غضون ساعتين. تظهر ما بعد العدوى أن العديد من البكتيريا هي البلعمة بواسطة الضامة الفلورية.

جرعة حقن من 250 CFU من النوع البري ستحث على استجابة قوية مؤيدة للالتهابات وهي قاتلة في غضون يوم واحد. في المقابل ، يؤدي الحقن الوريدي للأروم إلى عدوى مستمرة حيث تشكل البلاعم المصابة مجاميع ضيقة تعتبر المراحل الأولى من الأورام الحبيبية ، والتي هي السمة المميزة لمرض السل. يظهر التصوير متحد البؤر لمثل هذا الورم الحبيبي مثل الركام في خط EG المعدل وراثيا في خمسة أيام بعد الإصابة النمو داخل الخلايا لبكتيريا M Num المسماة M num.

داخل البلاعم الفلورية الخضراء ، يمكن حقن البكتيريا في البطين الخلفي للدماغ ، وهو عبارة عن حجرة خالية من البلاعم بعد 32 ساعة من الإخصاب حقن 20 إلى 100 M من الكرز المسمى بكتيريا M marum في هذه الحجرة يؤدي إلى التسلل السريع بواسطة البلاعم التي تقوم ببلعمة البكتيريا كما هو موضح هنا. باستخدام حقن M-P-X-E-G-F-P المعدل وراثيا لحوالي 20 CFU من Styria في الحويصلة الأذنية يؤدي إلى جذب العدلات في ثلاث ساعات بعد الإصابة. في حين أن هذه الاستجابة لا لوحظت في حقن التحكم في PBS ، فإن الحبل الظهري ، الذي يبدو أنه مقاوم للتسلل بواسطة الكريات البيض ، هو حجرة متساهلة لنمو طفرات الحقن التي يتم تخفيفها بشدة عند حقنها في أنسجة أخرى.

بعد حقن نير جرعة من 2240 CFU البكتيريا أقصام انتشرت على مدى عدة أيام في الأنسجة الجنينية وتشكل الورم الحبيبي مثل المجاميع. على غرار تلك التي لوحظت بطريقة الحقن الوريدي التقليدية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التدريج الصحيح لأجنة الزرد أمر بالغ الأهمية لأن الجهاز المناعي الجنيني يصبح مؤهلا بشكل متزايد أثناء التطور.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التنميط النسخي والكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية استجابة الجهاز المناعي الفطري الجنيني للعدوى المسببة للأمراض.