عزل Oligomers بي ار بي القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في دماغ الإنسان العادي

الهدف من هذا الإجراء هو فصل بروتين PRP الذائب وغير الذائب في جميع أربطة الدماغ البشري الطبيعي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجنيس أنسجة الدماغ البشري وعزل الكسور. بعد ذلك، يتم إجراء ترسيب السرعة في تدرجات السكروز المتدرجة.

ثم يتم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. وأخيراً، يتم التقاط PRP باستخدام بروتين الجين 5 أو G five P. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر عزل PRP الذائب وغير الذائب أو الربيطات من الدماغ البشري الطبيعي من خلال الطرد المركزي الفائق في تدرجات السكروز الخطوية، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، والتقاط PRP بواسطة G five P. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في أبحاث أمراض البريون، بما في ذلك مرض كروتزفيلد جاكوب، واعتلال الدماغ الإسفنجي البقري، وأمراض الهزال السريرية. وعلاوة على ذلك، يمكنها تقديم رؤى حول عزل البروتينات الأميلويدية الذائبة وغير الذائبة، ليس فقط لأمراض البريون، بل وأيضاً لأمراض أخرى مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطرق صعوبة لأن جميع الخطوات التجريبية مهمة وتتطلب عناية إضافية. ويعد العرض المرئي لهذه العملية أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن SEC Fi يتسم بالدقة العالية، كما أن عملية التقاط PRP باستخدام G five P تعد خطوات يصعب وصفها وقد لا تكتمل بدقة دون تشغيل أكثر إحكاماً. لتحضير متجانس الدماغ، ابدأ بإضافة 100 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى 100 mg من أنسجة الدماغ المجمدة باستخدام مدقة آلية، ثم قم بتجنيس الأنسجة على الثلج، وجمدها على الثلج الجاف لمدة خمس دقائق، ثم قم بتجنيسها مرة أخرى.

قم بتحضير متجانس دماغ كلي بتركيز 20% أو 10% عن طريق إضافة 300 أو 800 µL على التوالي من محلول التحلل (lysis buffer). باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بتدوير المتجانس عند 1000 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. اجمع الـ SNA في جهاز طرد مركزي برأس دوار من طراز S SW 55، ثم قم بتدوير الجزء S1 بسرعة 35,000 RPM لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب نظيف. قم بإعادة تعليق الراسب غير القابل للذوبان في المنظف في منظم التحلل لتحضير العينات لتقنية western blot. حضّن كسري S two و P two مع 50 micrograms per milliliter من proteinase K لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius.

أوقف عملية الهضم بإضافة 5 mM من PMSF ومحلول عازل لعينات SDS. اغْلِ العينات لمدة 10 دقائق ثم اتركها لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ولإجراء ترسيب السرعة، ابدأ بحضن 450 µL من كسر S one بنسبة 20% مع حجم مساوٍ من Sarco X بنسبة 2% في الماء على الثلج لمدة 30 دقيقة في أنابيب طرد مركزي سعة 5 mL. أضف 0.5 mL من كل من السكروز بتركيزات 60%، و30%، و25%، و20%، و15%، و10%، ثم حمّل 0.4 mL من S one المحضن فوق طبقة السكروز بتركيز 10 إلى 60%.

قم بإجراء عملية طرد مركزي للتدرجات الخطوية في جهاز طرد مركزي باستخدام دوار SW 55 بسرعة 48,000 RPM لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية من أعلى الأنبوب. اجمع 12 جزءاً متساوياً بحجم 283 µL لكل منها. استخدم 20 µL من كل جزء مع حجم مساوٍ من SDS sample buffer.

لتحضير عينات هلام SDS page. تُغلى العينات لمدة 10 دقائق، ثم تُبرد لمدة أربع دقائق. تُوضع العينات في جهاز الطرد المركزي بسرعة 1000 G لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، قم برجّها باستخدام جهاز vortex قبل تحميلها على هلام صبّ مسبقاً لفصل الحجم. يُستخدم الكروماتوغرافيا لتحديد الحالة الأوليغوميرية لجزيئات PRP. ابدأ بتحميل أحجام عينات مقدارها 200 µL من سبعة علامات كتلة جزيئية فردية على عمود مقاس 1 × 30 من حبيبات SUEx 200 HR.

استخدم حجم استخلاص blue dextran كحجم فراغي. احسب أحجام استخلاص القمة لـ VE من الكروماتوغرام والاحتجازات الكسرية. احسب معامل التوزيع KAV باستخدام المعادلة KAV تساوي V ناقص V zero مقسوماً على VT ناقص V zero.

لإنشاء منحنى معايرة، يتم رسم KAV للمعايير البروتينية مقابل لوغاريتم الوزن الجزيئي لهذه المعايير. بعد ذلك، يتم تطبيق 200 µL من S one على العمود بمعدل تدفق قدره 0.25 mL/min.

اغسل العمود باستخدام lysis buffer 1%cile، واستخدم جامع الكسور لاستخلاص كسور بحجم 0.25 milliliter. قم بتحضين 125 µL من كل كسر مع 500 µL من الميثانول المبرد مسبقاً عند درجة حرارة -20 °C لمدة ساعتين. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 13,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

ريز، قم بإعادة تعليق الراسب في 20 µL من منظم عينات SDS ثم اغله لمدة 10 دقائق. اتركه ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة ثم قم بفصله باستخدام هلام بولي أكريلاميد بتركيز 15%. استخدم المنحنى القياسي لاستقراء الأوزان الجزيئية لمختلف أنواع PRP المستعادة لربط جزيء G5P بالخرزات المغناطيسية.

يتم تحضين 100 µg من G five P مع 350 µL من حبيبات toci المغناطيسية المنشطة في 1 mL من PBS عند درجة حرارة 37 °C لمدة 20 ساعة. استخدم مغناطيسًا خارجيًا لجذب حبيبات G five P إلى الجدار الجانبي لأنابيب eppendorf ثم قم بإزالة المحلول. اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS 0.1%BSA لمنع الارتباط غير النوعي.

يتم تحضين الخرز المقترن بـ G five P في 1 mL من 0.2 M tris, HCL بـ pH 7.4 يحتوي على 0.1%BSA لمدة خمس ساعات عند 37 °C. بعد ذلك، تُغسل الخرز ثلاث مرات. يتم إزالة الغسلة الأخيرة وإضافة 1 mL من PBS لعزل PRP. يتم تحضين 100 µL من S one أو P two مع 60 µL من الخرز المقترن بـ G five B في 1 mL من محلول الربط (binding buffer) تحت تدوير مستمر لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.

ضع الأنبوب على المغناطيس. قم بإزالة المحلول واغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام محلول الغسيل المنظم. أزل الغسلة الأخيرة وأضف محلول عينات SDS.

قم بتسخين الحبيبات عند 95 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. قم بتحميل العينات على هلامات precast بتركيز 15% وشغلها عند 150 فولت لمدة 80 دقيقة تقريباً. انقل البروتينات إلى غشاء PVDF عند 70 فولت لمدة ساعتين بعد حجب الأغشية باستخدام 5% milk في محلول TBST.

قم بتحضينها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع أجسام PRP المضادة. 3F4 و 1E4 المضادة لـ N أو المضادة لـ C، وبعد التحضين مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بـ HRP، قم بتحضين الغشاء ومحلول التألق الكيميائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة وعرّض الفيلم كما هو موضح هنا مقارنة بعينات مرض كروتزفيلد جاكوب المتفرق أو CJD. تم اكتشاف كمية صغيرة من PRP الخلوي غير القابل للذوبان في جزء P2 من الأدمغة الطبيعية.

ومع ذلك، استُعيد معظم البروتين في الكسر S two. ويمثل البروتين المقاوم للبروتياز (PRP) غير القابل للذوبان حوالي 5 إلى 25% من إجمالي PRP، بما في ذلك الأنواع كاملة الطول والمبتورة من الطرف النهائي. وقد كشفت التحليلات باستخدام ترسيب تدرج السكروز المتدرج أنه بينما استُعيد معظم PRPC من الأدمغة غير المصابة بمرض كروتزفيلد-جاكوب (CJD) في الكسور العلوية، تم اكتشاف كميات صغيرة من PRP في الكسور السفلية 9-11 التي تحتوي عادةً على تجمعات كبيرة. وتتنوع أنواع PRP الممرضة أو PRP SC، بدءاً من المونومرات.

تم عزل الرباطات الأصغر والتجمعات الأكبر عن طريق الترشيح الهلامي في الدماغ المصاب بمرض yakup ذو صمام CRUT. ومن المثير للدهشة، تم اكتشاف كمية صغيرة من التجمعات الأكبر بوزن جزيئي يتجاوز 2000 kilodaltons في الأجزاء غير القابلة للذوبان من الأدمغة الطبيعية. علاوة على ذلك، لم يتم اكتشاف ثنائيات ورباعيات PRPC في الأجزاء غير القابلة للذوبان فحسب، بل وأيضاً في الأجزاء غير القابلة للذوبان.

بعد المعالجة بـ PK و P NGAs. تم الكشف عن PRP الذي التقطه G five P باستخدام antibody one E four ضد PRP 97 1 0 5 3. كما تم الكشف عن شظايا لب مقاومة لـ PK تسمى PRP asterisk 20 و PRP asterisk 19 و PRP asterisk seven، حيث هاجرت عند 20 kilodaltons و 19 kilodaltons و seven kilodaltons على التوالي.

ومع ذلك، لم يتم الكشف عن أي PRP عندما تم تحضين الجسم المضاد one E four مسبقاً مع ببتيد اصطناعي له تسلسل مطابق لـ one E four epitope، مما يشير إلى أن النطاقات التي اكتشفها one E four هي شظايا PRP. وقد كشف الجسم المضاد anti C عن شظيتين مختلفتين من PRP تهاجران عند حوالي 18 kilodaltons وحوالي 12 إلى 13 kilodaltons. بالإضافة إلى طريقة PRP ETE 20 Once.

يمكن إتمام هذه التقنية في غضون أربعة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الـ PRP polygamous الذائبة وغير الذائبة في الجزء السفلي من الدماغ البشري بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث المتعلقة بمصير PIP لاستكشاف معلومات التأكيد في الدماغ.