وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي
February 15th, 2012
وعموما الأغشية الحيوية الميكروبية التي تشكلها مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. وحيد الخلية تحليل هذه القطعان يتطلب استخدام للصحفيين فلوري. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور ورصد عدة subpopulationswithin ب. الرقيقة الأغشية الحيوية باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد المجموعات السكانية الفرعية المتميزة للخلايا المتخصصة التي تتمايز في الأغشية الحيوية للكائن الحي النموذجي ، العصيات الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال مراسلي النسخ أولا في كروموسوم الأجزاء الدقيقة B. سيتم التعبير عن هؤلاء المراسلين حصريا في السكان الفرعيين للخلايا قيد الدراسة.
تتمثل الخطوة التالية في تعزيز تطوير الأغشية الحيوية عن طريق زراعة المواد الدقيقة B في الوسط المحفز للغشاء الحيوي ، Mss GG gg. بعد تكوين الأغشية الحيوية ، يتم تشتيت الخلايا من الأغشية الحيوية وتثبيتها باستخدام بارا فورمالديهايد. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في الكشف عن إشارة التألق المنبعثة من الخلايا المفردة للمجتمع الميكروبي باستخدام التألق والفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي.
في النهاية ، تظهر النتائج كيف تخصصت الخلايا في الإنتاج والإفراز. المصفوفة خارج الخلية التي تشكل الأغشية الحيوية هي مجموعة سكانية فرعية مختلفة عن الخلايا التي تفرز الفاعل بالسطح ، جزيء الإشارات المسؤول عن تمايز السكان الفرعيين لمنتجي المصفوفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل القياس الكمي لتعبير النسخ باستخدام فحوصات Vita Ities لتحليل الأشعة الدقيقة ، هي أنها تسمح لنا بمراقبة التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة وتصور مجموعات الخلايا الصغيرة بشكل خاص من الخلايا المتخصصة للتعبير عن جين معين.
لن يتم الكشف عن هذه التعبيرات الجينية عند تحليل إجمالي السكان. تستخدم البلازميدات التكاملية لتصنيف B الدقيقة ويظهر مثال هنا. PTAA ، مروج الجينات المسؤولة عن إنتاج tass.
يتم استنساخ بروتين مصفوفة في الناقل باستخدام مواقع التقييد ECO R one و Hindi three. أصبح التعبير عن جين مراسل CFP الآن تحت سيطرة ptap A لبدء إجراء التسمية B ، وتعمل العناصر الدقيقة على خطية البلازميد التكاملي عن طريق الهضم الأنزيمي. إنزيم التقييد الموصى به هو XH oh one عندما يكون البلازميد التكاملي جاهزا ، يحفز الكفاءة الطبيعية في سلالة B الدقيقة 1 68 عن طريق تنمية الخلايا في وسط تحفيز الكفاءة لمدة خمس ساعات عند 37 درجة مئوية.
أضف البلازميد الخطي إلى ثقافة الخلايا B المختصة واحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية بعد ساعتين ، ثم ضع الخلايا على أجار باستخدام spect mycin واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يحتوي الكروموسوم B الدقيقي على موقعين محايدين ، Amy و E و E و LAC A ، والتي يمكن استخدامها لدمج اندماج المراسل دون التأثير على تطور الأغشية الحيوية. يندمج البلازميد الخطي PKM 0 0 8 في جينوم B الدقيقين عن طريق إعادة التركيب المزدوج.
الخطوة التالية هي نقل المراسل من السلالة المسماة إلى سلالة قادرة على تكوين أغشية حيوية باستخدام بروتوكول نقل العاثيات SPP واحد. لغرض هذا الفيديو ، يتم عرض الخطوات المهمة في البروتوكول فقط. قم بزراعة السلالة المانحة 1 68 ، مع إيواء اندماج المراسل في وسط TY عند 37 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلى المرحلة الثابتة المبكرة عند 200 ميكرولتر من الخلايا إلى 100 ميكرولتر من مخزون العاثيات المخفف في أنبوب زجاجي.
ودعونا نقف عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتسخين الماصة TY في الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق الدوامة. يوزع برفق على طبق TY جديد ويحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثماني إلى 16 ساعة للسماح بظهور هالات العاثية.
لجمع هالات العاثيات ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط TY إلى اللوحة واستخدم الماصة الزجاجية لتفتيت الأجار العلوي. انقل معلق أجار إلى أنبوب صقر سعة 15 مل. دوامة برفق لتفتيت الأجار ثم الطرد المركزي عند 1000 جم لمدة 15 دقيقة.
انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. مرر المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 22 ميكرون. استخدم هذا المادة الطافية لإصابة ثقافة السلالة المتلقية المزروعة في وسط TY.
أضف 30 ميكرولترا من المادة الطافية إلى 10 مل من الثقافة المخففة من واحد إلى 10 ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك جهاز الطرد المركزي عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة سبع دقائق ، قم بتعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسط TY وتنتشر على صفيحة تحتوي على SPECT mycin بالإضافة إلى 10 ملليمولار. سترات الصوديوم.
احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 36 ساعة. اختر مستعمرة وقم بزراعتها طوال الليل في LB سائل عند 37 درجة مئوية. أخيرا ، ضع ثلاثة ميكرولترات من المزرعة الليلية على وسط تحفيز الأغشية الحيوية الصلبة.
اسمح للخلايا بالنمو لمدة 72 ساعة عند 30 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام من النمو ، ستطور الأغشية الحيوية المتكونة على سطح أجار Ms.GG بنية مورفولوجية معقدة في سطح أجار. لبدء هذا الإجراء ، استخدم عود أسنان أو ملاقط لإزالة الأغشية الحيوية من سطح أجار MSGG.
يجب أن يتيح تناسق الأغشية الحيوية تقشيرها من سطح الأجار. في قطعة واحدة ، ضع الأغشية الحيوية في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت PBS ، وقم بتفريق الأغشية الحيوية بمقدار خفيف. قم بإجراء 12 نبضة بإخراج ثلاثة وسعة 0.7 ثانية لإصلاح العينات قبل تحليل الخلية الواحدة.
يعلق Resus 300 ميكرولتر من تعليق الخلية في مليلتر واحد ، وهو محلول ألدهيد 4٪ ، ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق بالضبط. بعد التثبيت لمدة سبع دقائق ، اغسل الخلايا في المخزن المؤقت PBS ثلاث مرات. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS قبل الفحص المجهري الفلوري.
قم بإعداد شريحة مجهر عن طريق سحب 200 ميكرولتر من 0.8٪ agros فوق الشريحة ، وتغطيتها بعناية بشريحة أخرى. بعد دقيقتين ، قم بإزالة الشريحة العلوية برفق للحصول على طبقة من agros متصلة بالشريحة في المكان السفلي. ميكرولترين من الخلايا الثابتة على سطح طبقة agros وتغطيتها بزجاج غطاء مجهري.
ضع العينة على مسرح المجهر الفلوري. اضبط فترة الإثارة وفقا لعنصر تحكم سلبي لا يظهر أي مضان في الظروف المختارة للتجربة. يجب أن يتراوح التعرض بين 50 إلى 200 مللي ثانية.
احصل على صورة مضان بالإضافة إلى صورة مجال ساطعة لكل مجال رؤية. لإعداد الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بتفريق عينة الخلايا الثابتة عن طريق صوتنة خفيفة. قم بإجراء سلسلتين من 12 نبضة بإخراج خمسة وسعة 0.7 ثانية لتفريق الكتل في خلايا مفردة دون التسبب في تحلل الخلايا.
تأكيد كفاءة تشتت الخلايا عن طريق المجهر الضوئي. بعد ذلك ، قم بتخفيف العينة إلى 100 في المخزن المؤقت PBS. سيتم استخدام مقياس خلوي BD فاكس كانتو لإجراء هذا التحليل لمضان YFP.
يتم استخدام إثارة ليزر عند 488 نانومتر إلى جانب مرشح 5 30 30 لمضان CFP. يتم استخدام إثارة ليزر عند 405 نانومتر إلى جانب مرشح 4 0 8 40 ، ومعايرة مقياس التدفق الخلوي باستخدام اثنين من عناصر التحكم السلبية. يجب أن تكون عينة من المخزن المؤقت PBS مع عدم وجود خلايا معلقة بمثابة عنصر تحكم سلبي لحجم الجسيم المستشعر بواسطة مقياس التدفق الخلوي.
يجب أن تكون العينة التي لا تحتوي على مراسل فلوري بمثابة عنصر تحكم سلبي لحساسية الفلورسنت للتدفق. مقياس الخلوي بعد المعايرة ، ضع العينة المسمى بمراسل الفلورسنت في مقياس التدفق الخلوي لكل عينة ، وقم بتحليل ما لا يقل عن 50،000 حدث بمعدل تدفق يتراوح بين 303،000 حدث في الثانية. عندما ينمو B Subtles على صفيحة من الوسط المحفز للأغشية الحيوية ، لوحظ تكوين الأغشية الحيوية MSGG بعد ثلاثة أيام من الحضانة عند 30 درجة مئوية.
يظهر الأغشية الحيوية بنية مورفولوجية معقدة تدل على المجموعات السكانية الفرعية المشاركة المتميزة. على سبيل المثال ، ينتج عن إنتاج المصفوفة خارج الخلية والأغشية الحيوية تكوين تجاعيد على سطح المستعمرة. يوضح هذا الشكل مثالا على تصور تمايز الخلايا في سلالة واحدة مصنفة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
تؤوي هذه السلالة مراسل الفلورسنت Ptap ، وهو CFP يتم التعبير عنه في السكان الفرعيين للخلايا المنتجة للمصفوفة الملونة باللون الأزرق. تنتج هذه المجموعة الفرعية وتفرز المصفوفة خارج الخلية التي تشكل الأغشية الحيوية. هذه الصورة التالية هي نتيجة التصور عن طريق المجهر الفلوري لسلالة مزدوجة التسمية تؤوي المراسل Ptap و A CFP والمراسل الإضافي P Surfactin YFP.
يتيح هذا المراسل الثاني مراقبة السكان الفرعيين للخلايا المسؤولة عن إفراز جزيء الإشارات الخافض للتوتر السطحي ، مما يؤدي إلى سلسلة الإشارات لتمايز منتجي المصفوفة. هنا ، يتم تلوين منتجي المصفوفة بشكل خاطئ باللون الأزرق ، في حين أن منتجي الفاعل بالسطح ملوءون بشكل خاطئ باللون الأصفر ، وهي نتائج قياس التدفق الخلوي ثنائي الأبعاد باستخدام سلالة واحدة تحمل علامة تؤوي ptap المراسل. يتم تقديم YFB هنا.
أظهرت سلالة التحكم غير المعالجة بدون أي جينات بروتين فلوري مجموعة سكانية واحدة ذات خلايا مضان نسبية منخفضة تؤوي ptap. لم يميز YFP في ظل ظروف غير محفزة للأغشية الحيوية بين السكان الفرعيين لمنتجي المصفوفة ، كما أظهر جميع السكان مضان نسبي منخفض. في المقابل ، في ظل ظروف تحفيز الأغشية الحيوية ، تم الكشف عن مجموعة سكانية فرعية من الخلايا ذات التألق النسبي المرتفع على أنها كتف على يمين التألق النسبي المنخفض.
تظهرهنا نتائج الذروة التي تم الحصول عليها من قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد. يتم تقديم إشارات التألق للقنوات التي تمت مراقبتها في المحور X للمحور YFP و Y بالنسبة ل CFP ، تظهر اللوحة اليسرى العلوية سلالة بدون جينات بروتين فلوري كعنصر تحكم في مضان الخلفية. في اللوحة العلوية اليمنى ، تم استخدام سلالة واحدة مصنفة للكشف عن السكان الفرعيين لمنتجي الفاعل بالسطح في قناة YFP المضان المؤطرة باللون الأصفر.
في اللوحة اليسرى السفلية ، تم استخدام سلالة واحدة مختلفة للكشف عن السكان الفرعيين لمنتجي المصفوفة. في قناة فلورة CFP المؤطرة باللون الأزرق ، تتم مراقبة المجموعات السكانية الفرعية لمنتجي المصفوفة ومنتجي الفاعل بالسطح باستخدام السلالة ذات العلامات المزدوجة ويتم تقديم النتائج. في هذه اللوحة اليمنى السفلية.
تم الكشف عن مجموعتين فرعيتين من الخلايا تعبر عن مستويات عالية من مراسلي الفلورسنت. يتم تأطير كل مجموعة توضح أنه لا يوجد تداخل في تعبير المراسلين بين المجموعتين الفرعيتين من الخلايا المتخصصة. يوضح هذا الشكل النهائي القياس الكمي للمجموعات السكانية الفرعية لمنتجي المصفوفة وأكل لحوم البشر عن طريق قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد.
في اللوحة اليمنى العليا ، تم استخدام سلالة واحدة مصنفة للكشف عن السكان الفرعيين لأكل لحوم البشر. في قناة مضان YFP المؤطرة باللون الأصفر ، تم وصف هذه المجموعة الفرعية من أكلة لحوم البشر للتمييز بشكل متناسق مع السكان الفرعيين لمنتجي المصفوفة. في اللوحة اليسرى السفلية ، يتم الكشف عن السكان الفرعيين لمنتجي المصفوفة في سلالة واحدة أخرى مسماة في قناة مضان CFP.
أظهرتالنتائج المؤطرة باللون الأزرق ، وأظهرت النتائج من السلالة ذات العلامات المزدوجة في اللوحة اليمنى السفلية مجموعة سكانية فرعية واحدة من الخلايا الفلورية التي تعبر عن كل من YFP من CFP مؤطرة باللون الأخضر. يشير التعبير المتزامن للمراسلين إلى أن كلا مساري تمايز الخلية يتم تنشيطهما بشكل منسق في نفس المجموعة الفرعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وتحديد المجموعات السكانية الفرعية المتميزة للخلايا التي تشكل غشاء حيوي ميكروبي باستخدام تحليل الخلايا الخلوية مثل الفحص المجهري الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
الموجز
يحدد هذا البروتوكول طريقة لرؤية وقياس المجموعات الفرعية المميزة للخلايا المتخصصة في الأغشية الحيوية لبكتيريا Bacillus subtilis. من خلال استخدام مراصد النسخ والتقنيات الفلورة، يمكن للباحثين مراقبة هذه المجموعات الفرعية بشكل فعّال.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الميكروبات
- بحوث الأغشية الحيوية
- تحليل الخلية
الخلفية
- تتكون الأغشية الحيوية الميكروبية من مجموعات فرعية متخصصة من الخلايا.
- التحليل الفردي للخلايا ضروري لفهم ديناميكيات الأغشية الحيوية.
- يتم استخدام المراسين الفلورسين لرؤية هذه المجموعات الفرعية.
- تستخدم بكتيريا Bacillus subtilis ككائن نموذجي لدراسات الأغشية الحيوية.
هدف الدراسة
- لرؤية المجموعات الفرعية المميزة في الأغشية الحيوية لـ B. subtilis.
- لقياس تمايز الخلايا المتخصصة.
- لتعزيز فهم بنية المجتمعات الميكروبية.
الطرق المستخدمة
- إدخال مراصد النسخ إلى كروموسوم B. subtilis.
- تعزيز تطور الأغشية الحيوية باستخدام وسط محفز للأغشية الحيوية.
- تفريق وتثبيت خلايا الأغشية الحيوية مع بارافورمالديهايد.
- كشف إشارات الفلورة عن طريق المجهر وقياس التدفق الخلوي.
النتائج الرئيسية
- رؤية ناجحة للمجموعات الفرعية المميزة للخلايا.
- قياس تمايز الخلايا المتخصصة في الأغشية الحيوية.
- تبرهن على الاستخدام الفعّال للمجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي.
- رؤى في بنية المجتمعات الميكروبية.
الخلاصات
- يمكن البروتوكول من تحليل مفصل للمجموعات الفرعية للأغشية الحيوية.
- المراسين الفلورسين ضرورية لدراسة الديناميكيات الميكروبية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنظمة ميكروبية أخرى لدراسات مماثلة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry enables precise quantification of specialized bacterial subpopulations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence in microbial community behavior, informing target validation and assay development for anti-biofilm strategies. The method's adaptability to other microbial models broadens its portfolio impact across infectious disease and microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of functionally distinct cell subpopulations within biofilms.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing matrix producers from surfactin producers at single-cell resolution.
- Improves predictive confidence in target selection by revealing spatial and temporal organization of microbial communities.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene expression heterogeneity in prokaryotic systems.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological systems for downstream screening of anti-biofilm compounds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs through flow cytometry and fluorescence microscopy.
- Enables standardization of reporter-based assays for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on specific biofilm subpopulations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing phenotypic heterogeneity in microbial communities.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by enabling single-cell resolution analysis.
- De-risks translational advancement by providing quantitative biomarkers of biofilm differentiation.
- Supports risk-adjusted decisions for advancing anti-biofilm candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for anti-biofilm and microbiome-targeted programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying gene expression in specialized subpopulations.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on biofilm architecture.
- Analytics: Delivers quantitative single-cell readouts for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity across model systems when studying microbial heterogeneity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse microbial models and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-biofilm and microbiome assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, fluorescence microscopy, and flow cytometry.
- Demands access to calibrated flow cytometers and high-sensitivity fluorescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of reporter constructs and analytical protocols.
- Adaptable to other microbial models with appropriate reporter integration strategies.
- Potential limitations include detection thresholds for rare subpopulations and need for rigorous controls.
