وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير وقياس المجموعات الفرعية المتميزة من الخلايا المتخصصة التي تتمايز في الغشاء الحيوي (biofilm) للكائن النموذجي، *Bacillus subtilis*. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إدراج مراسلين نسخيين (transcriptional reporters) في كروموسوم *B. subtilis*. وسيتم التعبير عن هذه المراسلين حصرياً في المجموعة الفرعية من الخلايا قيد الدراسة.

تتمثل الخطوة التالية في تحفيز تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) عن طريق زراعة بكتيريا B subtles في وسط تحفيز الغشاء الحيوي، Ms GG gg. وبعد تكوين الغشاء الحيوي، يتم تشتيت الخلايا الموجودة فيه وتثبيتها باستخدام الـ para formaldehyde. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في الكشف عن إشارة الفلورة المنبعثة من الخلايا المفردة للمجتمع الميكروبي باستخدام المجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

وفي نهاية المطاف، تُظهر النتائج كيفية تخصص الخلايا في الإنتاج والإفراز. فالخلايا التي تُكون المادة الخلالية خارج الخلوية التي تشكل الغشاء الحيوي الرقيق تمثل مجموعة فرعية مختلفة عن الخلايا التي تفرز المادة الخافضة للتوتر السطحي، وهي الجزيء الإشاري المسؤول عن تمايز المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقدير التعبير النسخي باستخدام مقايسات الحيوية أو تحليل المصفوفات الدقيقة، في أنها تتيح لنا مراقبة التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة وتصور المجموعات الخلوية الصغيرة جداً من الخلايا المتخصصة في التعبير عن جين معين.

لن يتم اكتشاف هذه التعبيرات الجينية عند تحليل المجتمع العام. تُستخدم البلازميدات التكاملية لوسم سلالات B subtles، وموضح مثال على ذلك هنا. PTAA هو المحفز للجينات المسؤولة عن إنتاج tass.

يتم استنساخ بروتين مصفوفة في الناقل باستخدام مواقع القطع ECO R one وHindi three. وأصبح التعبير عن الجين المراسل CFP الآن تحت تحكم ptap A. لبدء إجراء وسم B, subtles، يتم تحويل البلازميد التكاملي إلى شكل خطي عن طريق الهضم الإنزيمي. إن إنزيم القطع الموصى به هو XH oh one. وعندما يصبح البلازميد التكاملي جاهزاً، يتم تحفيز الكفاءة الطبيعية في سلالة B subtlest 1 68 عن طريق تنمية الخلايا في وسط تحفيز الكفاءة لمدة خمس ساعات عند 37 °C.

أضف البلازميد المخطى إلى مزرعة خلايا B subtlest المختصة واحضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية، وبعد مرور ساعتين، انثر الخلايا على آغار يحتوي على spect mycin واحضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يحتوي كروموسوم B subtles على موقعين محايدين، وهما Amy, E, E و LAC A، واللذان يمكن استخدامهما لدمج اندماجات المراسل دون التأثير على تطور الغشاء الحيوي. يندمج البلازميد المخطى PKM 0 0 8 في جينوم B subtles عن طريق إعادة التركيب المزدوج.

تتمثل الخطوة التالية في نقل المراسل من السلالة الموُسّمة إلى سلالة قادرة على تكوين الأغشية الحيوية باستخدام بروتوكول تحويل العاثيات SPP one. ولأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض الخطوات الهامة فقط في البروتوكول. قم بتنمية السلالة المانحة 1 68، التي تحمل اندماج المراسل، في وسط TY عند 37 درجة مئوية حتى تصل المزرعة إلى مرحلة الثبات المبكرة، وذلك بإضافة 200 microliters من الخلايا إلى 100 microliters من مخزون العاثيات المخفف في أنبوب زجاجي.

ثم نتركها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل Agar TY الرخو الساخن بواسطة الماصة إلى الأنبوب والمزج جيداً باستخدام جهاز vortex. يتم التوزيع بلطف على طبق TY جديد والتحضين عند 37 °C لمدة تتراوح من 8 إلى 16 ساعة للسماح بظهور هالات العاثيات.

لجمع هالات العاثيات، أضف ثلاثة milliliters من وسط TY إلى الطبق واستخدم الماصة الزجاجية لتفتيت الآجار العلوي. انقل معلق الآجار إلى أنبوب فالكون سعة 15 milliliter. استخدم جهاز الفورتكس بلطف لتفتيت الآجار، ثم قم بالطرد المركزي عند 1000 G لمدة 15 minutes.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. مرر السائل الطافي عبر مرشح حقنة بمسامية 22 micron. استخدم هذا السائل الطافي لإصابة مزرعة من السلالة المستقبلة المُنمّاة في وسط TY.

أضف 30 µL من السائل الطافي إلى 10 mL من المزرعة المخففة بنسبة 1:10، واحضن المزيج لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي بسرعة 5,000 RPM لمدة سبع دقائق، ثم أعد تعليق الراسب في 200 µL من وسط TY وافرده على طبق يحتوي على SPECTmycin بالإضافة إلى 10 mM من سترات الصوديوم.

يُحضن المزيج عند 37 °C لمدة تتراوح بين 12 إلى 36 ساعة. يتم اختيار مستعمرة واحدة وتنميتها طوال الليل في وسط LB السائل عند 37 °C. وأخيرًا، يتم وضع 3 µL من المزرعة الليلية على وسط صلب محفز لتكوين الغشاء الحيوي (biofilm).

اترك الخلايا لتنمو لمدة 72 ساعة عند 30 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام من النمو، ستطور الأغشية الحيوية المتكونة على سطح آجار Ms.GG بنية مورفولوجية معقدة على سطح الآجار. لبدء هذا الإجراء، استخدم عود أسنان أو ملقطاً لإزالة الغشاء الحيوي من سطح آجار MSGG.

يجب أن تسمح قوام الغشاء الحيوي (biofilm) بإمكانية تقشيره من سطح الآجار. ضع الغشاء الحيوي كقطعة واحدة في 3 mL من محلول PBS المنظم، وقم بتشتيت الغشاء الحيوي بلطف. قم بإجراء 12 نبضة بقدرة 3 وسعة 0.7 s لتثبيت العينات قبل تحليل الخلية الواحدة.

أعد تعليق 300 µL من معلق الخلايا في 1 mL من محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4%، وحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق بالضبط. بعد عملية التثبيت التي استغرقت سبع دقائق، اغسل الخلايا في محلول PBS المنظم ثلاث مرات. وأخيرًا، أعد تعليق الخلايا في 300 µL من محلول PBS المنظم قبل الفحص بالمجهر الفلوري.

قم بتحضير شريحة مجهرية عن طريق سحب 200 µL من agros بتركيز 0.8% ووضعها فوق الشريحة، ثم تغطيتها بعناية بشريحة أخرى. بعد مرور دقيقتين، قم بإزالة الشريحة العلوية بلطف للحصول على طبقة من agros ملتصقة بالشريحة السفلية. ضع 2 µL من الخلايا المثبتة على سطح طبقة agros ثم غطها بغطاء شريحة مجهرية.

ضع العينة على منصة مجهر الفلورة. اضبط فترة الإثارة وفقاً لعينة ضابطة سالبة لا تظهر أي فلورة في الظروف المختارة للتجربة. يجب أن يتراوح زمن التعريض بين 50 إلى 200 milliseconds.

التقط صورة فلورية وصورة بالمجال المضيء لكل مجال رؤية. ولتحضير الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي، قم بتشتيت عينة الخلايا المثبتة عن طريق استخدام الموجات فوق الصوتية الخفيفة. قم بإجراء سلسلتين مكونتين من 12 نبضة بقدرة خمسة وسعة 0.7 seconds لتشتيت التكتلات إلى خلايا مفردة دون التسبب في تحلل الخلايا.

تأكد من كفاءة تشتت الخلايا باستخدام المجهر الضوئي. بعد ذلك، خفف العينة بنسبة 1 إلى 100 في محلول PBS المنظم. سيتم استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي BD fax canto two لهذا التحليل للكشف عن فلورية YFP.

يُستخدم استثارة ليزرية عند 488 nanometers مقترنة بمرشح 5 30 30 لفلورة CFP. وتُستخدم استثارة ليزرية عند 405 nanometers مقترنة بمرشح 4 0 8 40، مع معايرة جهاز قياس التدفق الخلوي باستخدام ضابطين سلبيين. ويجب أن تعمل عينة من محلول PBS المنظم بدون خلايا معلقة كضابط سلبي لحجم الجسيمات التي يستشعرها جهاز قياس التدفق الخلوي.

يجب أن تُستخدم عينة تفتقر إلى المراسل الفلوري كعنصر تحكم سلبي للتحسس الفلوري لجهاز قياس التدفق الخلوي. بعد المعايرة، ضع العينة الموصومة بمراسل فلوري في جهاز قياس التدفق الخلوي، وقم بتحليل 50,000 حدث على الأقل لكل عينة بمعدل تدفق يتراوح بين 303,000 حدث في الثانية. عندما تنمو B Subtles على طبق من الوسط المحفز لتكوين الغشاء الحيوي MSGG، يُلاحظ تكوين الغشاء الحيوي بعد ثلاثة أيام من الحضن عند 30 °C.

يُظهر الغشاء الحيوي (biofilm) بنية مورفولوجية معقدة تشير إلى وجود مجموعات فرعية متميزة من الخلايا المشاركة. على سبيل المثال، يؤدي إنتاج المصفوفة خارج الخلوية والأغشية الحيوية إلى تكوين تجاعيد على سطح المستعمرة. يوضح هذا الشكل مثالاً على تصور تمايز الخلايا في سلالة واحدة مُعلمة باستخدام المجهر الفلوري.

تحمل هذه السلالة المراسل الفلوري Ptap, A CFP الذي يتم التعبير عنه في المجموعة الفرعية من الخلايا المنتجة للمادة الخلالية والملونة باللون الأزرق. تقوم هذه المجموعة الفرعية بإنتاج وإفراز المادة الخلالية خارج الخلوية التي تشكل الغشاء الحيوي. الصورة التالية هي نتيجة التصوير بواسطة المجهر الفلوري لسلالة مزدوجة الوسم تحمل المراسل Ptap, A CFP والمراسل الإضافي P Surfactin YFP.

يتيح هذا المراسل الثاني مراقبة المجموعة الفرعية من الخلايا المسؤولة عن إفراز جزيء الإشارة surfactin، والذي يحفز سلسلة إشارات تمايز منتجي المادة الخلالية (matrix producers). هنا، تظهر الخلايا المنتجة للمادة الخلالية بلون أزرق اصطناعي، بينما تظهر الخلايا المنتجة لـ surfactin بلون أصفر اصطناعي، وهي نتائج قياس التدفق الخلوي ثنائي الأبعاد (2D flow cytometry) باستخدام سلالة واحدة موسومة تحمل المراسل ptap. يتم عرض YFB هنا.

أظهرت السلالة الضابطة غير المعالجة، والتي تخلو من أي جينات للبروتينات الفلورية، مجتمعاً واحداً من الخلايا ذات الفلورية النسبية المنخفضة الحاملة لـ ptap. ولم يؤدِ استخدام YFP في ظل ظروف غير محفزة لتكوين الغشاء الحيوي إلى تمييز المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية (matrix producers)، كما أظهر المجتمع بأكمله فلورية نسبية منخفضة. وفي المقابل، تم اكتشاف مجموعة فرعية من الخلايا ذات فلورية نسبية عالية تحت ظروف محفزة لتكوين الغشاء الحيوي، حيث ظهرت ككتف على يمين منطقة الفلورية النسبية المنخفضة.

تظهر هنا نتائج الذروة التي تم الحصول عليها من قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد (3D flow cytometry). تم عرض إشارات الفلورة للقنوات التي تمت مراقبتها في المحور X لـ YFP والمحور Y لـ CFP، حيث يوضح اللوح العلوي الأيسر سلالة لا تحتوي على جينات البروتين الفلوري كعنصر تحكم للفلورة الخلفية. وفي اللوح العلوي الأيمن، تم استخدام سلالة واحدة موسومة للكشف عن المجموعة الفرعية من منتجي السورفاكتين (surfactin) في قناة فلورة YFP المؤطرة باللون الأصفر.

في اللوحة السفلية اليسرى، استُخدمت سلالة مفردة مُعلمة مختلفة للكشف عن المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية (matrix producers). وفي قناة فلورة CFP المؤطرة باللون الأزرق، تتم مراقبة المجموعات الفرعية من منتجي المادة الخلالية ومنتجي المواد الخافضة للتوتر السطحي (surfactant producers) باستخدام السلالة المزدوجة التعليم، وتظهر النتائج في هذه اللوحة السفلية اليمنى.

يتم اكتشاف مجموعتين فرعيتين من الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من المراسلين الفلوريين. تظهر كل مجموعة مؤطرة لبيان عدم وجود تداخل في تعبير المراسلين بين المجموعتين الفرعيتين من الخلايا المتخصصة. يوضح هذا الشكل النهائي التحديد الكمي للمجموعات الفرعية من منتجي المادة الخلالية والخلايا الكانسة (cannibals) بواسطة قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد (3D flow cytometry).

في اللوحة العلوية اليمنى، استُخدمت سلالة واحدة موسومة للكشف عن المجموعة الفرعية من الكائنات آكلة بني جنسها. في قناة فلورة YFP المؤطرة باللون الأصفر، وُصفت هذه المجموعة الفرعية من آكلي بني جنسهم بأنها تتمايز بالتنسيق مع المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية. وفي اللوحة السفلية اليسرى، يتم الكشف عن المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية في سلالة موسومة واحدة أخرى في قناة فلورة CFP.

أظهرت النتائج الخاصة بالسلالة الموصومة المزدوجة في اللوحة السفلية اليمنى، والمؤطرة باللون الأزرق، مجموعة فرعية واحدة من الخلايا الفلورية التي تعبر عن كل من YFP وCFP المؤطر باللون الأخضر. ويشير التعبير المتزامن للمراسلين الاثنين إلى أن مساري تمايز الخلايا يتم تنشيطهما بشكل منسق في نفس المجموعة الفرعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس المجموعات الفرعية المتميزة من الخلايا التي تشكل الغشاء الحيوي الميكروبي باستخدام تحليل الخلايا لمجتمع الخلايا، مثل المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.