عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من عدم التجانس الخلوية من الدماغ ضروري للتحقيق في دورها في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية. هذا البروتوكول يصف العزلة الميكانيكية والمختلطة تقنية زراعة الخلايا التي توفر عائدات عالية ونقاء عالية، وقابلة للحياة خلايا دبقية صغيرة الرئيسي لل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد مزارع الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية من أدمغة الفئران حديثي الولادة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الدماغ أولا وإزالة السحايا. الخطوة الثانية هي تجانس الدماغ وتقطيع مزرعة الدبقية المختلطة إلى قوارير T 75.

بعد ذلك ، يتم تحضين القوارير لمدة 10 إلى 14 يوما حتى تصل طبقة أحادية الخلية النجمية إلى التقاء. الخطوة الأخيرة هي هز القوارير لإطلاق الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنمو فوق الطبقة الأحادية للخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى ثقافة نقية من الخلايا الدبقية الصغيرة. في النهاية ، يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية النقاء في زراعة الخلية المفردة اللاحقة في المختبر وفحوصات الزراعة المشتركة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل طريقة التدرج Perico ، هي أن الاضطراب الميكانيكي الاسمي يقلل من الخلل الوظيفي أو التنشيط الدبقي الدقيق ، ويمكن إنشاء الخلايا الدبقية الصغيرة للتجارب لأسابيع بعد التحضير الأولي. سأعرض هذا الإجراء مع تامي تيرو ، طالبة الدراسات العليا في مختبر حرس الدكتور كليفتون داو. يمكن استخدام ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاء التي تم تحقيقها خلال هذا البروتوكول في التجارب المختبرية لدراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، بالإضافة إلى ظروف الأمراض المرضية.

الخلايا الدبقية الصغيرة ، والاستجابة لتلف الأنسجة ، وكذلك المحفزات الالتهابية لها صلة مباشرة بالإصابة العصبية وحالات الأمراض التنكسية العصبية. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم ليسوا على دراية بكيفية إزالة السحايا من أنسجة المخ في الوقت المناسب من أجل تقليل تلوث الخلايا الليفية في مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب الحرص على عدم إتلاف الطبقة الأحادية للخلايا النجمية أثناء اهتزاز القوارير والتعامل مع ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة.

للتحضير للإجراء ، فإن Chi Livi عبارة عن L 15 وسائط إلى أربع درجات مئوية ، وهي جاهزة لأطباق بتري مقاس 60 × 15 ملم تحتوي على وسائط L 15 وتوضع على الثلج. قم بتسخين وسط الثقافة إلى 37 درجة مئوية وتأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية. بعد قطع رأس جرو P واحد إلى P خمسة جرذان بمقص حاد ، قم بإسقاط الرأس في 70٪ من الإيثانول.

بعد جمع رؤوس خمسة صغار فئران ، انقل الرؤوس إلى محلول ملحي. قم بإزالة الدماغ بالكامل من كل رأس عن طريق عمل شقوق بعناية على جانبي الجمجمة فوق الأذنين ، وسحب الدماغ للخارج إلى إحدى مشكلات بتري التي تحتوي على وسط L 15 على الجليد. بمجرد نقل الأدمغة الخمسة الأولى إلى L 15 على الجليد ، يمكن معالجة الجراء الخمسة التالية بنفس الطريقة عندما يتم جمع كل الأدمغة.

قم بإزالة السحايا عن طريق الإمساك برفق بحافة الصفيحة السحائية بالملقط وتقشيرها بعناية بعيدا عن القشرة الأساسية. من الضروري إزالة السحايا تماما والقيام بذلك في أسرع وقت ممكن. بعد إزالة السحايا ، انقل كل دماغ إلى طبق بتري طازج من L 15 وسط على الثلج.

استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لشفط أنسجة المخ والوسط من الصفيحة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا. ثم جهاز طرد مركزي عند 2 ، 500 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد شفط الطرد المركزي.

ثم يستخدم supinate ماصة معقمة 10 مليلتر إلى Reese. قم بتعليق الحبيبات في أربعة إلى خمسة ملليلتر من وسائط L 15 الطازجة ، وقم بسحب الوسائط والأنسجة لأعلى ولأسفل 10 مرات. بعد ذلك ، ضع مصفاة خلوية مسام 100 ميكرون على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.

استخدم ماصة معقمة سعة خمسة ملليلتر لسحب تعليق الأنسجة لأعلى ولأسفل ، ثم مع مسح الماصة إلى مصفاة الخلية ، قم بتوزيع المادة من خلال مصفاة الخلية في الأنبوب المخروطي. اشطف المصفاة بأربعة إلى خمسة ملليلتر من وسائط L 15 المبردة الطازجة. ثم قم بالطرد المركزي 2 ، 500 RCF لمدة خمس دقائق من أربع درجات مئوية.

لكل دماغ جرو فأر تمت معالجته ، قم بإعداد قارورة معقمة T 75 عن طريق إضافة 12 مل من وسائط ثقافة ما قبل الحرب إلى كل قارورة. بعد ذلك ، بعد شفط الأنبوب الطبيعي من الخلايا المحببة ، أضف خمسة إلى ستة ملليلتر من وسائط المزرعة إلى حبيبات الخلية ، وقم برفع وأسفل 10 مرات باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر. ثم انقل حجما متساويا من تعليق الخلية إلى كل قارورة T 75.

احتضان القوارير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع إلى ثلاثة أسابيع ، مما يسمح للخلايا بالجلوس دون إزعاج خلال الأيام الخمسة الأولى بعد الطلاء الأولي. بعد خمسة أيام ، استبدل الوسط المكيف في كل قارورة ب 12 مل من الوسط الطازج لتحقيق الالتقاء. يجب أن يتم ذلك بعناية فائقة دون لمس الجزء السفلي من القارورة حيث تلتصق الخلايا.

بمجرد أن تلتقي الثقافات الدبقية المختلطة تماما ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. قم بتغطية أغطية القارورة ببرام لمنع تبادل الغازات مع الهواء البيئي وضع القوارير في حاضنة اهتزازية مضبوطة على 100 دورة في الثانية و 37 درجة مئوية لمدة ساعة بعد انقضاء الساعة ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لتجميع الوسائط من القوارير دون تعطيل طبقة الخلايا النجمية وتوزيعها في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلترا. أضف وسائط جديدة إلى القوارير والعودة إلى الحاضنة.

بعد الطرد المركزي للأنابيب عند 2 ، 500 RCF لمدة خمس دقائق من أربع درجات مئوية ، قم بشفط supinate وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط الطلاء الدبقية الصغيرة. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي البشري والإجراءات القياسية. بمجرد تحديد عدد الخلايا ، أضف حجما مناسبا من وسائط الطلاء الدبقية الصغيرة لتحقيق خلية.

تركيز اثنين في 10 إلى الخلايا الخمس لكل لوحة مليلتر مناسب للتجربة والعودة إلى الحاضنة. للسماح للدبقية الصغيرة بالالتصاق بين عشية وضحاها. كانت الخلايا عبارة عن صبغة مناعية مع جسم مضاد خاص ل IBA one ، وهي علامة دبقية صغيرة ، والتي تظهر باللون الأحمر.

هناك حد أدنى من تلوث الثقافة بالخلايا العصبية كما يتضح من هذه الصورة المجهرية للتلطيخ المناعي باستخدام جسم مضاد لعلامة الخلايا العصبية NA الجديدة ، والتي تظهر باللون الأحمر. تم تلطيخ الشريحة بعدادات DPI لتلطيخ جميع نوى الخلية باللون الأزرق. تظهر هذه الصورة تلطيخا مناعيا باستخدام GFAP وعلامة الخلايا النجمية.

تظهر الخلايا النجمية باللون الأخضر. هنا نرى صورة لمزرعة الخلايا الدبقية الصغيرة المناعية ملطخة بجسم مضاد خاص ب CC one ، وهي علامة قليلة التغصن. تظهر الخلايا قليلة التغصن باللون الأحمر.

يوضح هذا الرسم البياني نتائج القياس الكمي لكل نوع من أنواع الخلايا. يمكن ملاحظة أن ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة المطلية نقية أكثر من 90٪. تظهر صورة المجهر الفلوري هذه ثقافة دبقية صغيرة كانت وصمة عار مناعية ل IBA.

المناطق الحمراء هي حبات اللاتكس الفلورية. تمت معالجة ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الموضحة هنا بنانوغرام واحد لكل مليلتر من عديد السكاريد اللبيض ، ويمكن ملاحظة أن الخلايا الدبقية الصغيرة لديها بلعمة حبات اللاتكس المسماة بالفلورسنت. هنا ، يتم عرض نتائج فحص البلعمة في الرسم البياني.

لوحظ زيادة البلعمة بعد العلاج ب LPS. يوضح هذا الشكل أن إنتاج أكسيد النيتريك يزداد أيضا في مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة بعد إضافة LPS. أخيرا ، تكون كل من ثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة المنفصلة المباشرة أو العابرة عرضة لزيادة موت الخلايا بعد الحضانة باستخدام LPS كما تم قياسه عن طريق إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات بمجرد إتقان الجزء الأول من هذه التقنية ، حتى الطلاء في T 75 ، يمكن عمل القوارير في ساعة ونصف ، ويمكن إجراء الإجراء الكامل في غضون أسبوعين.

هناك اعتبار آخر أثناء تحسين هذا البروتوكول وهو تحديد المدة الزمنية. يجب الحفاظ على الثقافات الدبقية المختلطة قبل عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للطلاء بعد إنشاء ثقافات عالية النقاء. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في القياس المختبري لإنتاج أكسيد النيتريك ، وإطلاق السيتوكين والكيموكين ، بالإضافة إلى النشاط المرحلي وقياسه باستخدام المقايسات المعملية الروتينية.

وبالتالي ، مع تطوير هذا الإجراء ، يتمتع الباحثون في مجال علم الأعصاب بالقدرة على استكشاف نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة في بيئة خلوية متجانسة والتحقيق في أدوارهم في ظل ظروف عصبية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من أدمغة الفئران حديثي الولادة. عن طريق عزل الدماغ أولا وإزالة السحايا ، ثم تجانس الدماغ والطلاء في قوارير ، يتم تحضين القوارير لمدة 10 إلى 14 يوما حتى تصل طبقة أحادية الخلية النجمية إلى التقاء.

الخطوة الأخيرة هي هز القوارير لإطلاق الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنمو فوق الطبقة الأحادية للخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى ثقافة نقية من الخلايا الدبقية الصغيرة.