عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مستنبتات أولية لخلايا دبقية صغيرة من أدمغة الجرذان حديثة الولادة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الدماغ وإزالة السحايا. وتتمثل الخطوة الثانية في تجنيس الدماغ وزراعة المستنبت الدبقي المختلط في دوارق T 75.

بعد ذلك، يتم تحضين الدوارق لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً حتى تصل طبقة الخلايا النجمية أحادية الطبقة إلى حالة التلاقي. وتتمثل الخطوة النهائية في رج الدوارق لتحرير الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنمو فوق طبقة الخلايا النجمية، مما يؤدي إلى الحصول على مزرعة نقية من الخلايا الدبقية الصغيرة. وفي النهاية، يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية النقاء في تجارب زراعة الخلايا المفردة أو تجارب الزراعة المشتركة اللاحقة في المختبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل طريقة تدرج بيريكو (Perico gradient method) في أن التفكيك الميكانيكي الاسمي يقلل من خلل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة أو تنشيطها، ويمكن إنتاج الخلايا الدبقية الصغيرة للتجارب لعدة أسابيع بعد التحضير الأولي. سأقوم بشرح هذا الإجراء بالتعاون مع تامى تيرو، وهي طالبة دراسات عليا في مختبر الدكتور كليفتون داوغارد. يمكن استخدام مستنبتات الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاء التي يتم الحصول عليها من خلال هذا البروتوكول في تجارب خارج الجسم (in vitro) لدراسة وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في الظروف الفسيولوجية الطبيعية، وكذلك في حالات الأمراض المرضية.

إن استجابة الخلايا الدبقية الصغيرة (Microglia) لتلف الأنسجة وكذلك المحفزات الالتهابية لها علاقة مباشرة بالإصابات العصبية وحالات الأمراض التنكسية العصبية. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب عدم إلمامهم بكيفية إزالة السحايا من أنسجة الدماغ في الوقت المناسب من أجل تقليل تلوث الخلايا الليفية في مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الطبقة الأحادية من الخلايا النجمية أثناء رج الدوارق والتعامل مع مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة.

للاستعداد للإجراء، يتم تبريد وسط L 15 إلى 4 °C، وتجهيز أطباق بتري مقاس 60 × 15 مم تحتوي على وسط L 15 ووضعها على الثلج. يتم تدفئة وسط المزرعة إلى 37 °C والتأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية. بعد قطع رأس جرو جرذ من عمر P1 إلى P5 باستخدام مقص حاد، يُوضع الرأس في إيثانول 70%.

بعد جمع رؤوس خمسة من صغار الجرذان، انقل الرؤوس إلى محلول ملحي. قم بإزالة الدماغ كاملاً من كل رأس عن طريق إجراء شقوق بعناية على جانبي الجمجمة فوق الأذنين، ثم اسحب الدماغ وضعه في أحد أطباق بيتري التي تحتوي على وسط L 15 على الثلج. وبمجرد نقل الأدمغة الخمسة الأولى إلى وسط L 15 على الثلج، يمكن معالجة الصغار الخمسة التاليين بنفس الطريقة حتى يتم جمع جميع الأدمغة.

قم بإزالة السحايا عن طريق الإمساك بطرف غشاء السحايا برفق باستخدام الملقط وتقشيره بعناية بعيداً عن القشرة التي تقع تحته. من الضروري إزالة السحايا بالكامل وبأسرع وقت ممكن. بعد إزالة السحايا، انقل كل دماغ إلى طبق بتري جديد يحتوي على وسط L 15 على الثلج.

استخدم ماصة سعة 10 milliliter لسحب أنسجة الدماغ والوسط من الطبق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 milliliter. ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 2, 500 RCF لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربعة °C. وبعد عملية الطرد المركزي، قم بسحب السائل.

يستخدم الباحث بعد ذلك ماصة معقمة سعة 10 milliliter لإعادة تعليق الراسب في أربعة إلى خمسة milliliters من وسط L 15 الطازج، مع سحب الوسط والأنسجة بالماصة صعوداً وهبوطاً 10 مرات. بعد ذلك، يتم وضع مصفاة خلايا ذات مسام بحجم 100 micron على أنبوب مخروطي طازج سعة 50 milliliter.

استخدم ماصة معقمة سعة خمسة ملليلتر لسحب معلق الأنسجة وإطلاقه عدة مرات، ثم مع لصق الماصة بمصفاة الخلايا، قم بتفريغ المادة عبر مصفاة الخلايا في الأنبوب المخروطي. اشطف المصفاة من أربعة إلى خمسة ملليلتر من وسط L 15 المبرد والطازج. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي عند 2, 500 RCF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة أربع درجات مئوية.

لكل دماغ جرو جرذ تمت معالجته، قم بتجهيز دورق T 75 معقم عن طريق إضافة 12 milliliters من وسط استنبات مُدفأ مسبقاً إلى كل دورق. بعد ذلك، وبعد سحب الطافي من الخلايا المترسبة، أضف من خمسة إلى ستة milliliters من وسط الاستنبات إلى كتلة الخلايا المترسبة، ثم قم بالماصة صعوداً وهبوطاً 10 مرات باستخدام ماصة سعة 10 milliliters. بعد ذلك، انقل حجماً متساوياً من معلق الخلايا إلى كل دورق T 75.

تُحضن القوارير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بتركيز 5% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من أسبوع إلى ثلاثة أسابيع، مع ترك الخلايا دون تحريك خلال الأيام الخمسة الأولى بعد الزرع الأولي. وبعد مرور خمسة أيام، يُستبدل الوسط المُكيَّف في كل قارورة بـ 12 ملليلتر من وسط طازج للوصول إلى مرحلة الالتحام الخلوي. ويجب القيام بذلك بحذر شديد دون لمس قاع القارورة حيث تلتصق الخلايا.

بمجرد أن تصبح المزارع الدبقية المختلطة متلاقية تماماً، أخرج القارورة من المحضن. قم بتغطية سدادات القارورة بـ Parafilm لمنع تبادل الغازات مع الهواء المحيط، وضع القوارير في محضن هزاز مضبوط على 100 RPS و37 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد انقضاء الساعة، استخدم ماصة سعة 10 milliliter لجمع الوسط من القوارير دون تعريض طبقة الخلايا النجمية للاضطراب، ثم صبّه في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. أضف وسطاً جديداً إلى القوارير وأعدها إلى المحضن.

بعد طرد الأنابيب مركزياً عند 2,500 RCF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة أربع درجات مئوية، يتم سحب السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد ذلك، يتم عد الخلايا باستخدام مقياس الخلايا البشري وبالإجراءات القياسية. وبمجرد تحديد عدد الخلايا، يتم إضافة الحجم المناسب من وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة للوصول إلى التركيز الخلوي المطلوب.

يُعد تركيز 2 × 10⁵ خلية لكل مليلتر في الطبق مناسباً للتجربة، ثم يتم إعادتها إلى الحاضنة للسماح للخلايا الدبقية الصغيرة (microglia) بالالتصاق طوال الليل. تم صبغ الخلايا مناعياً باستخدام جسم مضاد متخصص لـ IBA1، وهو مؤشر للخلايا الدبقية الصغيرة، والذي يظهر باللون الأحمر.

يوجد حد أدنى من التلوث في المزرعة بالخلايا العصبية كما يظهر في صورة المجهر هذه للصبغ المناعي باستخدام جسم مضاد لعلامة NA العصبية الجديدة، والتي تظهر باللون الأحمر. وقد صُبغت الشريحة صبغة تباينية باستخدام DPI لتلوين جميع نوى الخلايا باللون الأزرق. وتظهر هذه الصورة الصبغ المناعي باستخدام GFAP وعلامة الخلايا النجمية.

تظهر الخلايا النجمية باللون الأخضر. ونرى هنا صورة للمستنبت الخلايا الدبقية الصغيرة مصبوغة مناعياً بجسم مضاد محدد لـ CC one، وهو واسم للخلايا الدبقية قليلة التغصن. وتظهر الخلايا الدبقية قليلة التغصن باللون الأحمر.

يوضح هذا المدرج التكراري نتائج تقدير كمية كل نوع من الخلايا. ويمكن ملاحظة أن مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة المزروعة نقية بنسبة تزيد عن 90%. وتظهر صورة المجهر الفلوري هذه مزرعة خلايا دبقية صغيرة خضعت للصبغ المناعي لبروتين IBA1.

تمثل المناطق الحمراء حبيبات لاتكس موسومة فلوريسنتياً. وقد عولجت مزرعة الخلايا الدبقية الصغيرة الموضحة هنا بـ 1 ng/mL من عديد السكاريد الدهني، ويمكن ملاحظة أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد قامت ببلعمة حبيبات اللاتكس الموسومة فلوريسنتياً. وهنا، تُعرض نتائج مقايسة البلعمة في مخطط مدرج.

يُلاحظ زيادة في عملية البلعمة بعد العلاج بـ LPS. يوضح هذا الشكل أن إنتاج أكسيد النيتريك يزداد أيضاً في مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة بعد إضافة LPS. وأخيراً، تكون مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة والعصبونات، سواء كانت مباشرة أو مفصولة بإدراج transwell، عرضة لزيادة موت الخلايا بعد الحضانة مع LPS، وهو ما يتم قياسه عن طريق إطلاق lactate dehydrogenase. وبمجرد إتقان الجزء الأول من هذه التقنية، يمكن إتمام الخطوات وصولاً إلى الزراعة في دوارق T 75 في غضون ساعة ونصف، ويمكن إنجاز الإجراء كاملاً في غضون أسبوعين.

هناك اعتبار آخر أثناء تحسين هذا البروتوكول وهو تحديد المدة الزمنية؛ حيث يجب الحفاظ على مستنبتات الدبق المختلطة قبل عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية لزراعتها، وذلك بعد إنشاء مستنبتات عالية النقاء. وباستخدام هذا الإجراء، يمكن تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث يمكن تحديد وقياس إنتاج أكسيد النيتريك، وإفراز السيتوكينات والكيموكينات، بالإضافة إلى النشاط الطوري، وذلك باستخدام المقايسات المختبرية الروتينية.

وبذلك، ومع تطوير هذا الإجراء، تتاح للباحثين في مجال العلوم العصبية القدرة على استكشاف نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة في بيئة خلوية متجانسة واستقصاء أدوارها في ظل ظروف عصبية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستنبتات أولية من الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة الجرذان حديثي الولادة. يتم ذلك من خلال عزل الدماغ أولاً وإزالة السحايا، ثم تجنيس الدماغ وتوزيعه في الدوارق، ومن ثم تحضين الدوارق لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً حتى تصل طبقة الخلايا النجمية الأحادية إلى مرحلة التلاقي.

تتمثل الخطوة النهائية في رج الدوارق لتحرير الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنمو فوق طبقة الخلايا النجمية أحادية الطبقة، مما يؤدي إلى الحصول على مزرعة نقية من الخلايا الدبقية الصغيرة.