زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسريع تحليل التمايز العصبي للخلايا السلفية العصبية البشرية المزروعة في بيئة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا أولا في مصفوفة الهيدروجيل النقية القائمة على الببتيد ذاتية التجميع. بعد ذلك ، يتم إطلاق الخلايا من السقالات ثلاثية الأبعاد.

في الخطوة الثالثة ، يتم إجراء تلطيخ كيميائي نباتي مناعي للخلايا في الخطوة الأخيرة. يتم تعداد الخلايا عن طريق تحليل التدفق الخلوي. في النهاية ، يمكن تحديد معدل تمايز الخلايا العصبية أو معدل موت الخلايا المبرمج من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي للعلامات العصبية أو موت الخلايا المبرمج على التوالي.

باستخدام هذه التقنية ، يكون القياس الكمي للتمايز العصبي أسرع بكثير وبيانات Optane غربا في قاعدة أوسع وتقنيات التصوير الفوتوغرافي الدقيقة لتضمين الخلايا في المصفوفة النقية ، ضع أولا غطاء زجاجي معقم بقطر 13 ملم ينزلق في كل من بئرين من لوحة ثقافة الخلايا المكونة من أربع آبار. ثم قم بتخزين الطبق على مقعد نظيف لاستخدامه لاحقا. بعد ذلك ، افصل الخلايا السلفية العصبية البشرية أو H NPCs عن طريق إضافة 2.5 مل من التربسين المحضر حديثا.

بنزون محلول لطبق الثقافة واحتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد خمس دقائق ، أوقف التفاعل باستخدام مثبط التربسين benzon محلول. ثم بعد تدوير الخلايا المنفصلة عند 3000 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، قم بتعليق الحبيبات الناتجة بخمسة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 10٪ ، ثم اغسل تعليق الخلية في نفس ظروف الطرد المركزي.

بعد التخلص من snat Resus ، قم بتعليق الحبيبات في محلول السكروز إلى تركيز خلية نهائي واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. الآن في أسرع وقت ممكن ، امزج 60 ميكرولتر من تعليق الخلية مع المحلول الأول ، انقل 120 ميكرولترا من هذا التعليق إلى الأنبوب المخروطي مع المحلول الثاني واخلطه بعناية ثم قم بوضع 100 ميكرولتر من الخليط على الفور على كل زلات من الغطاء في لوحة البئر الأربعة. أخيرا ، أضف ببطء 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر.

بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، أضف 200 ميكرولتر أخرى من وسائط زراعة الخلايا إلى الآبار التي تبدأ التجميع الذاتي للمصفوفة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على المنطقة الساخنة من مقعدك النظيف. الامتناع عن تحريك لوحة زراعة الخلايا قدر الإمكان بعد تجميع المصفوفات، استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لإزالة معظم الوسائط وليس كلها لتجنب جفاف المصفوفات.

ثم اغسل المصفوفات ب 500 ميكرولتر من الوسائط الطازجة لمدة 10 دقائق. أخيرا ، قم بإزالة وسائط الغسيل. أضف 500 ميكرولتر إضافي من الوسائط وضع لوحة الثقافة في حاضنة.

إن أمكن. قم بتخزين المصفوفات في حاضنة خاصة بها لتجنب الاهتزاز العرضي للهياكل في اليوم الأول من تجربة التلوين. قم بإزالة الوسائط من المصفوفات بماصة سعة 1000 ميكرولتر ثم اغسل السقالات باستخدام PBS مرة واحدة لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإزالة PBS وأضف 400 ميكرولتر من البارالديهايد إلى كل بئر لإصلاح المصفوفات واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إصلاح السقالات ، اغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق. ثم احتضان الهياكل وسد المخزن المؤقت لمدة ست إلى تسع ساعات ، وقم بتغيير المخزن المؤقت مرة كل ساعتين إلى ثلاث ساعات مع حضانة أخيرة طوال الليل في مخزن مؤقت حجب جديد عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر.

أضف محلول الجسم المضاد إلى الآبار واحتضان المصفوفات مرة أخرى عند أربع درجات مئوية طوال الليل. الآن ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل السقالات في 500 ميكرولتر من PBS لمدة ثماني ساعات ، وقم بتغيير PBS كل ساعتين ثم بعد ذلك بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية باستخدام PBS الطازج. بعد الغسيل طوال الليل ، قم بإزالة PBS واحتضان السقالات بمحلول الجسم المضاد الثانوي لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

ثم اغسل العينات باستخدام PBS أربع إلى ست مرات لمدة ساعة واحدة في كل مرة ، ثم احتضن الهياكل ب PBS طازج عند أربع درجات مئوية في الظلام طوال الليل. أضف الآن 50 ميكرولترا من MOE all dab co على شرائح المجهر لإعدادها لتركيب المصفوفات. ثم قم بتركيب زلة غطاء بعناية على كل شريحة.

أخيرا ، استخدم مجهر فلوري للحصول على صور مجهرية مفردة و Zacks مشابهة لتلطيخ H NPCs باللون الأخضر للتعبير عن العلامة العصبية بيتا ثلاثة توبولين كما هو موضح هنا. بعد غسل السقالات ب 500 ميكرولتر من HBSS لمدة دقيقة واحدة ، استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لنقل السقالات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك ، أعد تعليق محلول الخلية عدة مرات باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتعطيل المصفوفات ميكانيكيا وبعد ذلك قم بالطرد المركزي لمحلول السقالة عند 3000 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول بنزين التربسين عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بعد خمس دقائق باستخدام مليلتر واحد من مثبط التربسين. ماصة محلول بنزا لأعلى ولأسفل عدة مرات بعد تدوير تعليق الخلية في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي.

قم بإزالة أي حطام مصفوفة عن طريق غسل الخلايا بملليلترين من المخزن المؤقت HBSS مرتين. أخيرا ، قم بإزالة الركام عن طريق تمرير محلول تعليق الخلية عبر جهاز طرد مركزي مصفاة خلية 70 ميكرون في نفس الظروف وجمع الخلايا في وسط زراعة الخلايا. ابدأ بتثبيت الخلايا المصنفة في 1٪ باراالديهايد باراكليم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.

ثم بعد تدوير الخلايا reus ، قم بتعليق الحبيبات في مخزن الغسيل. الآن بعد الطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 350 مرة G عند أربع درجات مئوية ، قم بتعليق الحبيبات الناتجة في 25 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد. احتضان تعليق الخلية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر.

ثم أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت pon مباشرة إلى العينات ، ثم اغسل معلقات الخلية مرتين في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي. بعد الغسيل الثاني ، أضف 25 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي ثم احتضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم بعد غسل الخلايا مرتين أخريين باستخدام عازلة الصابونين ، قم بتعليق الحبيبات و 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لتحليل التدفق الخلوي.

في هذا الشكل ، تظهر H NPCs المغلفة والنقية ، تنمو الخلايا في الهياكل الكروية ، وهي هياكل كثيفة حيث يمكن أن يصل قطر الكرات إلى عدة مئات من الميكرونات بين المجالات. يمكن ملاحظة حزم العمليات التي أنشأتها الخلايا كما هو موضح في الأسهم البيضاء. على الرغم من أنه بالكاد يمكن التعرف على الخلايا الفردية ، إلا أن الخلايا المغلفة في مصفوفة نقية مكملة باللامينين تنمو في هياكل أقل كثافة ويتم توزيعها بشكل أكثر تجانسا كما هو موضح في هذا الشكل ، يمكن التعرف على الخلايا المفردة في مناطق أقل كثافة كما هو موضح في الأسهم السوداء هنا ، تم تمييز H NPCs لمدة أربعة أيام في تلطيخ Matrixx المكملة باللون الأخضر للتعبير عن العلامة العصبية.

يظهر بيتا ثلاثة توبولين لتقييم النسبة المئوية للخلايا الموجبة. يمكن تحديد العدد الإجمالي للخلية عن طريق تعداد نوى الخلايا الملطخة هنا باللون الأزرق مع dappy. تمثل هذه الصورة المصغرة الإسقاط الكامل لكومة Z من الصور الملتقطة بمجهر الفلورسنت.

يمكن وضع الخلايا المنبعثة من المصفوفة مرة أخرى ، على سبيل المثال ، على زلات الغطاء كما هو موضح في هذا الشكل لمزيد من الدراسات الوظيفية. تظهر هذه الصورة الدقيقة الخلايا المزروعة في 3D بعد تعرضها لإجراء الإطلاق المذكور سابقا وزراعتها لمدة ثلاثة أيام. يكشف تلطيخ بيتا ثلاثة توبولين باللون الأحمر عن مورفولوجيا مماثلة للخلايا المستضافة في السقالة ثلاثية الأبعاد باستخدام الخلايا غير الملوثة كعنصر تحكم سلبي.

تم تمثيل GA هنا حيث تم تعيين الإطار الأسود للتحليل اللاحق لخلايا بيتا الموجبة للتوبولين في هذه الخلايا الموجبة في هذه النقطة ، تظهر الخلايا الموجبة داخل الإطار الأسود في الجزء الأيمن من المحور x ويمكن أيضا ملاحظة السكان الوسيطين في الإطار المنقط وعلى الأرجح التي تمثل حطام الخلية. تظهر مقارنة بين العد اليدوي للخلايا والتعداد عن طريق قياس التدفق الخلوي في هذا الشكل النهائي. يمكن اكتشاف نسبة أعلى بكثير من الخلايا الموجبة عن طريق تحليل التدفق الخلوي كما هو موضح في المربعات السوداء المفتوحة ، ثم يمكن تعدادها عادة عن طريق العد اليدوي كما هو موضح في المثلثات السوداء الصلبة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المقاييس الضعيفة لزراعة MPCs الحافة في سقالة ثلاثية الأبعاد ، وكيفية تحرير الخلايا من السقالة لمحللات قياس cyto المتدفقة.