زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسريع تحليل التمايز العصبي للخلايا السلفية العصبية البشرية المستنبتة في بيئة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنبات الخلايا أولاً في المصفوفة النقية من الهيدروجيل القائم على الببتيدات ذاتية التجميع، ثم يتم بعد ذلك تحرير الخلايا من السقالات ثلاثية الأبعاد.

في الخطوة الثالثة، يتم إجراء التلوين الكيميائي النسيجي المناعي للخلايا في المرحلة النهائية. ثم يتم تعداد الخلايا باستخدام تحليل التدفق الخلوي. وفي النهاية، يمكن تحديد معدل التمايز العصبي أو معدل الموت الخلوي المبرمج من خلال تحليل التدفق الخلوي للعلامات العصبية أو علامات الموت الخلوي المبرمج على التوالي.

باستخدام هذه التقنية، يكون قياس التمايز العصبي أسرع بكثير، وتُرفع بيانات Optane على قاعدة أوسع وتقنيات التصوير المجهري. لتضمين الخلايا في المصفوفة النقية، ضع أولاً شريحة غطاء زجاجية معقمة بقطر 13 مليمتر في كل من بئرين من أطباق زراعة الخلايا ذات الأربعة آبار. ثم خزن الطبق في وحدة تنقية الهواء (clean bench) لاستخدامه لاحقاً. بعد ذلك، قم بفصل الخلايا السلفية العصبية البشرية أو H NPCs عن طريق إضافة 2.5 ملليلتر من التريبسين المُحضّر حديثاً.

أضف محلول Benzon إلى طبق الزرع، ثم قم بحضن معلق الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide. وبعد مرور خمس دقائق، أوقف التفاعل باستخدام محلول trypsin inhibitor benzon. ثم بعد تدوير الخلايا المنفصلة عند 3000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، أعد تعليق الراسب الناتج باستخدام 5 mL من محلول sucrose بتركيز 10%، ثم اغسل معلق الخلايا تحت نفس ظروف الطرد المركزي.

بعد التخلص من محلول Resus، قم بتعليق الراسب في محلول السكروز للوصول إلى تركيز خلوي نهائي قدره 1×10⁶ خلية/ملليلتر. الآن، وبأسرع ما يمكن، اخلط 60 µL من معلق الخلايا مع المحلول رقم 1، ثم انقل 120 µL من هذا المعلق إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المحلول رقم 2 واخلطهما بعناية، وبعد ذلك قم فوراً بوضع 100 µL من الخليط على كل شريحة غطاء في الطبق ذي الأربع فجوات. وأخيراً، أضف ببطء 200 µL من وسط استزراع الخلايا إلى كل فجوة.

بعد مرور دقيقتين إلى ثلاث دقائق، أضف 200 µL أخرى من وسط زراعة الخلايا إلى الآبار لبدء التجميع الذاتي للمصفوفة. قم بحضن الخلايا عند 37 °C لمدة ساعة واحدة على المنطقة المسخنة من وحدة التنقية (clean bench). وتجنباً لتحريك طبق زراعة الخلايا قدر الإمكان بعد تجميع المصفوفات، استخدم ماصة سعة 1000 µL لإزالة معظم الوسط دون إزالته بالكامل لتفادي جفاف المصفوفات.

ثم اغسل المصفوفات باستخدام 500 µL من الوسط الغذائي الطازج لمدة 10 دقائق. وأخيرًا، قم بإزالة وسط الغسيل. أضف 500 µL أخرى من الوسط الغذائي وضع طبق المزرعة في المحضنة.

إذا كان ذلك متاحاً، احفظ المصفوفات في حاضنة خاصة بها لتجنب هز الهياكل عن طريق الخطأ في اليوم الأول من تجربة الصبغ. قم بإزالة الأوساط من المصفوفات باستخدام ماصة 1000 µL، ثم اغسل السقالات باستخدام PBS مرة واحدة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS وأضف 400 µL من البارالدهيد (paraldehyde) إلى كل بئر لتثبيت المصفوفات، واتركها لتحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد تثبيت السقالات، اغسلها باستخدام 500 µL من PBS لمدة خمس دقائق. ثم قم بتحضين الهياكل في محلول الحجب (blocking buffer) لمدة تتراوح من ست إلى تسع ساعات، مع تغيير المحلول مرة كل ساعتين إلى ثلاث ساعات، على أن تنتهي العملية بتحضين نهائي طوال الليل في محلول حجب جديد عند درجة حرارة 4 °C، وفي اليوم التالي، قم بإزالة محلول الحجب.

أضف محلول الأجسام المضادة إلى الآبار واحضن المصفوفات مرة أخرى عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. الآن، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأولية واغسل السقالات في 500 µL من PBS لمدة ثماني ساعات، مع تغيير PBS كل ساعتين، ثم تلي ذلك عملية غسيل طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية باستخدام PBS جديد. بعد الغسيل الليلي، قم بإزالة PBS واحضن السقالات مع محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

بعد ذلك، اغسل العينات بمحلول PBS من أربع إلى ست مرات لمدة ساعة واحدة في كل مرة، ثم حضن الهياكل في محلول PBS طازج عند درجة حرارة 4 °C في الظلام طوال الليل. الآن، أضف 50 µL من MOE all dab co على شرائح المجهر لتجهيزها لتثبيت المصفوفات. ثم قم بتثبيت غطاء شريحة بعناية على كل شريحة.

أخيراً، استخدم مجهراً فلورياً للحصول على صور مجهرية مفردة ولقطات مشابهة لـ H NPCs المصبوغة باللون الأخضر للتعبير عن الواسم العصبي beta three tubulin الموضح هنا. بعد غسل السقالات بـ 500 µL من HBSS لمدة دقيقة واحدة، استخدم ماصة 1000 µL لنقل السقالات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. بعد ذلك، أعد تعليق المحلول الخلوي عدة مرات باستخدام ماصة 1000 µL لتفكيك المصفوفات ميكانيكياً، ثم قم بطرد محلول السقالات مركزياً عند 3000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، وأزل السائل الطافي باستخدام ماصة، ثم أعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول trypsin benzine عن طريق السحب والطرد بالماصة عدة مرات.

بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا عند 37 °C. يتم إيقاف التفاعل بعد خمس دقائق بإضافة 1 mL من مثبط التريبسين. يتم سحب محلول Benzonase وطرده بالماصة عدة مرات بعد تدوير معلق الخلايا تحت ظروف الطرد المركزي ذاتها.

أزل أي بقايا مصفوفية عن طريق غسل الخلايا بمقدار 2 mL من منظم HBSS مرتين. وأخيراً، أزل التجمعات بتمرير محلول معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron باستخدام جهاز طرد مركزي تحت نفس الظروف، ثم اجمع الخلايا في وسط زراعة الخلايا. ابدأ بتثبيت الخلايا المفككة في 1% paraformaldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.

بعد ذلك، وبعد تدوير الخلايا لأسفل، قم بتعليق الراسب في محلول غسيل. والآن، بعد طرد الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 350 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية، أعد تعليق الراسب الناتج في 25 µL من محلول الأجسام المضادة. ثم قم بتحضين تعليق الخلايا لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.

بعد ذلك، أضف 300 µL من محلول pon buffer مباشرة إلى العينات، ثم اغسل معلقات الخلايا مرتين تحت نفس ظروف الطرد المركزي. وبعد الغسلة الثانية، أضف 25 µL من الجسم المضاد الثانوي، ثم حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد ذلك، وبعد غسل الخلايا مرتين إضافيتين باستخدام محلول saponin buffer، أعد تعليق الراسب في 500 µL من محلول الغسيل لإجراء تحليل التدفق الخلوي.

يظهر في هذا الشكل الخلايا السلفية العصبية البشرية (H NPCs) المغلفة والمصفوفة النقية؛ حيث تنمو الخلايا في هياكل كروية كثيفة التعبئة، ويمكن أن يصل قطر هذه الكرات إلى عدة مئات من الميكرونات فيما بينها. ويمكن ملاحظة حزم من الاستطالات التي كونتها الخلايا كما تشير الأسهم البيضاء. ورغم أنه يصعب تمييز الخلايا الفردية، إلا أن الخلايا المغلفة في مصفوفة نقية مدعمة باللامينين تنمو في هياكل أقل كثافة وتتوزع بشكل أكثر تجانساً كما يتضح في هذا الشكل، بل ويمكن تمييز خلايا مفردة في المناطق الأقل كثافة كما تشير الأسهم السوداء. هنا، خضعت الخلايا السلفية العصبية البشرية (H NPCs) للتمايز لمدة أربعة أيام في مصفوفة نقية مدعمة باللامينين، مع صبغها باللون الأخضر للدلالة على تعبير الوسم العصبي.

يظهر بيتا ثلاثة توبولين لتقييم النسبة المئوية للخلايا الإيجابية. ويمكن تحديد العدد الإجمالي للخلايا من خلال تعداد أنوية الخلايا المصبوغة هنا باللون الأزرق باستخدام dappy. تمثل هذه الصورة المجهرية الإسقاط الكامل لمجموعة Z من الصور التي تم التقاطها باستخدام مجهر فلوري.

يمكن إعادة تثبيت الخلايا التي تم تحريرها من القالب، على سبيل المثال، على شرائح غطاء كما هو موضح في هذا الشكل لإجراء المزيد من الدراسات الوظيفية. تُظهر هذه الصورة المجهرية خلايا تمت زراعتها ثلاثية الأبعاد بعد إخضاعها لإجراء التحرير المذكور سابقاً وزراعتها لمدة ثلاثة أيام. ويكشف صبغ beta three tubulin باللون الأحمر عن شكل مورفولوجي مماثل للخلايا المستضافة في السقالة ثلاثية الأبعاد، مع استخدام خلايا غير مصبوغة كعينة ضابطة سالبة.

تم ضبط البوابة (GA) الممثلة هنا بالإطار الأسود لتحليل الخلايا الموجبة لـ beta three tubulin لاحقاً؛ وفي مخطط النقاط هذا، تظهر الخلايا الموجبة ضمن الإطار الأسود في الجزء الأيمن من محور x، كما يمكن ملاحظة مجموعة وسيطة في الإطار المنقط والتي تمثل على الأرجح حطاماً خلوياً. يوضح هذا الشكل النهائي مقارنة بين عد الخلايا يدوياً والعد بواسطة قياس التدفق الخلوي. ويمكن اكتشاف نسبة أعلى بكثير من الخلايا الموجبة عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي، كما تشير المربعات السوداء المفتوحة، مقارنة بما يمكن عده عادةً بالعد اليدوي، كما تشير المثلثات السوداء المصمتة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مقاييس الفقيرة لزراعة الخلايا السلفية الميزنكيمية (MPCs) الطرفية في سِقالة ثلاثية الأبعاد، وكيفية تحرير الخلايا من السِقالة لاستخدامها في أجهزة تحليل التدفق الخلوي.