Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

المجهر Multiphoton من أجهزة الماوس كله هو ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير، ولكن ليس كل البروتوكولات الحفاظ على إشارة الفلورسنت من البروتينات الفلورية. باستخدام أسلوب المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف وكحول البنزيل: بنزيل بنزوات المقاصة، وتبين لنا صور عالية الدقة multiphoton من مخ الفأر كله معربا عن YFP.

ما يقتصر الفحص المجهري متعدد الفوتون للأنسجة الثابتة على أعماق اختراق ضحلة تبلغ بضع مئات من الميكرونات فقط. لقد أظهرنا مؤخرا أول استخدام للفحص المجهري متعدد الفوتون بعمق يصل إلى عدة ملليمترات في أعضاء الفأر الثابتة باستخدام المقاصة البصرية بمحلول كحول البنزو والبنزويل بنزوات. عرضنا الأولي ، صورت هذه التقنية مضان الأنسجة الجوهرية.

ومع ذلك ، هناك اهتمام متزايد باستخدام طرق المقاصة البصرية مع الأنسجة التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت مثل GFP. نقدم هنا بروتوكولا للفحص المجهري متعدد الفوتون لأنسجة المخ التي تم تطهيرها بنفس محلول الكحول البنزو الذي يحافظ على تألق البروتين الفلوري الأصفر الذي يعبر عنه الفخذ. محفز واحد في دماغ الفأر أصبح تصوير عضو الفأر الكامل عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون ممكنا عن طريق تنظيف العضو بصريا قبل التصوير دون تطهيره. متعدد الفوتونات.

يقتصر تصوير الدماغ على 300 ميكرون تحت سطح الأنسجة بسبب تأثيرات التشتت البارزة الناتجة عن الاختلافات في مؤشرات الانكسار للماء والبروتينات التي تتكون منها أنسجة المخ. للتغلب على هذا القيد ، يتم تجفيف العضو واستبدال الماء بسائل له معامل انكسار مماثل للبروتينات التي يتكون منها الأنسجة. تساعد عملية المسح البصري هذه على تقليل تشتت الضوء بشكل كبير لتقديم تصوير أفضل تحت سطح الأنسجة.

توضح الصور من باتا وآخرون كيف يمكن تطبيق هذه التقنية لعرض أنسجة أعضاء الفئران المختلفة باستخدام التألق الجوهري والجيل التوافقي الثاني. هذه الصورة الأولى لخصية الفأر ، تم التقاطها على بعد 1.4 ملم تحت سطح الأنسجة. تسمح لنا خاصية الدقة العالية للفحص المجهري متعدد الفوتون بالتكبير وإلقاء نظرة واضحة على خلايا المنوية الفردية التي تتشكل في الأنابيب

كما هو موضح في أقصى اليمين هنا، نعرض صورة لرئة الفأر، والتي تم التقاطها أيضا على عمق 1.4 ملم تحت سطح الأنسجة. هذه الصورة عبارة عن عرض توضيحي لتصوير متعدد الفوتون ثنائي القناة حيث يتم تمييز مكونات الإيلاستين باللون الأحمر بينما يتم تمييز الكولاجين باللون الأخضر ، ويمكن تمييز التكبير في oli الفردي بسهولة. أخيرا ، نعرض صورا عالية الدقة للمناطق الداخلية لدماغ الفأر تأخذ 850 ميكرون تحت سطح الأنسجة من خلال تكبير القشرة المخية الحديثة والحصين في الدماغ ، يمكن رؤية الخلايا النجمية الفردية وأجسام الخلايا العصبية بوضوح.

ومع ذلك ، عند تطهير الأعضاء بصريا التي يمكن أن تحتوي على بروتينات الفلورسنت مثل YFP ، فإن بروتوكول المقاصة البصري للبدرة لا يحافظ على إشارة الفلورسنت لهذه البروتينات الفلورية. البروتوكول المقدم هنا هو طريقة جديدة لإجراء المقاصة البصرية للأعضاء بالكامل وتصوير التواء الفأر مع الحفاظ على إشارة الفلورسنت ل YFP والخلايا العصبية التي تجفف الدماغ باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول وتطهير بمحلول واحد إلى اثنين من بنزوات بنزو الكحول ، والمعروف أيضا باسم BAB ، لتقليل الضرر الذي يلحق ببروتينات الفلورسنت والحفاظ على إشارة الفلورسنت الخاصة بها. للتصوير متعدد الفوتونات ، يتم وزن فئران YFP أولا ثم تخديرها بحقن داخل الصفاق من الكيتامين زيلازين.

يجب تأكيد لوحة التخدير الجراحية قبل الشروع في الجراحة. يجب فحص كل خمس دقائق لمعرفة ما إذا كان يتفاعل مع إصبع القدم الصلب أو قرص الذيل. إذا كان يتفاعل ، يلزم وجود جرعة تكميلية S من الكيتامين زيلازين.

بمجرد التخدير ، تبقى الفئران عن طريق لصق كل طرف على سرير جراحي باستخدام شريط مختبر بحيث يكون الفأر في وضع ضعيف يعرض صدره للجراحة للبدء ، يتم إجراء شق أسفل عملية الخنجري من أجل عمل قطع على طول قاعدة القفص الصدري باستخدام المقص والملاقط لسحب الجلد للخلف أثناء إجراء القطع ، ثم يتم تكوين قطعتين على جانبي قص الفأر لإنشاء رفرف من الأنسجة يتم إبعاده عن تجويف الصدر باستخدام إرقاء لترك القلب مكشوفا. بعد ذلك ، يتم إدخال إبرة قياس 23 في البطين الأيسر للقلب ، ويتم إجراء شق صغير في جدار عضلة الأذين الأيمن للسماح للدم بالهروب. مباشرة بعد قطع الأذين الأيمن ، يبدأ التروية بأربع درجات مئوية من المحلول الملحي المقيد بالفوسفات حتى لا يتم تصريف المزيد من الدم من الأذين الأيمن.

أثناء التروية ، يتم استخدام مضخة رسباضية وضبطها على قوة ضخ تخرج السائل على بعد 1.5 إلى بوصتين من طرف الإبرة. بمجرد تصريف الدم بالكامل ، يتم تحويل وسط التروية إلى محلول ألدهيد طفيلي الشكل بنسبة 4٪ عند أربع درجات مئوية حتى يصبح جسم الفأر صلبا وصلبا بشكل ملحوظ. بعد التروية ، تتم إزالة الفأر من سرير الجراحة وقطع رأسه لبدء استئصال الدماغ باستخدام الملقط ومقص القزحية.

تتم إزالة الجمجمة في أقسام صغيرة تبدأ من الجزء الخلفي من الجمجمة وتتحرك للأمام. يتم إجراء جروح صغيرة كل ملليمترين إلى أربعة ملليمترات باستخدام المقص عبر الجمجمة بينما يتم استخدام الملقط لسحب العظم بعناية بعيدا عن الدماغ في أقسام صغيرة ، ويتم ذلك حتى يتعرض السطح العلوي للدماغ بالكامل. ثم يتم استئصال الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة جراحية ووضعه لأخذ قارورة زجاجية من 4٪ ألدهيد paraform لإصلاحها لمدة ست ساعات.

بينما نركز بشكل أساسي على تصوير دماغ الفأر الذي يعبر عن YFP لهذا العرض التوضيحي ، سنقوم أيضا بتنظيف الفأر والساق الخلفية وقسم الأمعاء الدقيقة بصريا لإظهار قدرات المقاصة لهذا الإجراء بشكل أفضل. بعد التثبيت اللاحق ، يتم غسل الدماغ والأنسجة الأخرى مرتين في PBS. ثم يتم تجفيف عينات الأنسجة في درجة حرارة الغرفة بواسطة سلسلة من حضانات الإيثانول بتركيزات 50٪ 70٪ و 90٪ و 100٪ إيثانول.

تستمر كل حضانة لمدة ساعتين ثم ثانية. يتم إجراء حضانة الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 12 ساعة لاستخراج الماء بكفاءة من الأنسجة الثابتة. بعد الجفاف ، يتم سكب آخر محلول إيثانول بنسبة 100٪ ويتم غمر عينات الأنسجة في محلول واحد لواحد من الإيثانول إلى BAB لمدة ساعتين قبل غمرها في محلول مقاصة 100٪ BAB.

بمجرد دخولك إلى الباب، ستصبح عينات الدماغ والأنسجة الأخرى شفافة بشكل ملحوظ في غضون أربع إلى خمس ساعات. نعرض هنا مقطع فيديو بفاصل زمني للساعات الست الأولى من عملية المقاصة البصرية. يشير التخطي إلى الوقت الذي تم فيه استبدال المحلول الفردي من الإيثانول إلى BAB بمحلول 100٪ BAB.

في نهاية ست ساعات ، تظهر جميع الأعضاء علامة على الشفافية ، على سبيل المثال ، أصبح العظم الموجود في الساق الخلفية للفأر مرئيا الآن بوضوح للحصول على أفضل نتائج المقاصة. يجب ترك الدماغ لينظف لمدة ستة أيام في درجة حرارة الغرفة بينما يكون محميا من الضوء الساطع. بمجرد تنظيف الدماغ وجاهزيته للتصوير ، يتم لصقه في قاع طبق بتري باستخدام أكريليك سانو أو الغراء الفائق.

بعد أن يجف الغراء ، يظهر الدماغ في BAB ويتم وضع طبق بتري تحت هدف التصوير. للتصوير ، نستخدم مجهر متعدد الفوتون يشتمل على ليزر ياقوت من التيتانيوم MI Tie قابل للتعديل بين طول موجة إثارة 710 إلى 990 نانومتر. الطول الموجي للإثارة الذي نستخدمه لتوليد إشارات YFP هو 886 نانومتر.

ثم يتم التقاط إشارة الفلورسنت العاكسة باستخدام هدف أيقونة NIK خمسة x الذي يسمح بتصوير مجال رؤية كبير. يتم تصفية إشارة الفلورسنت العاكسة باستخدام مرشح تمرير 5 35 50 نطاقا ويتم تجميعها باستخدام مجلد عالي الكفاءة الكمومية. تتم معالجة المضاعف الثاني من صور OMA Matsu باستخدام برنامج مسح الصور بدقة 2048 × 2048 بكسل باستخدام معدل مسح يبلغ مللي ثانية لكل سطر لإنشاء صور YFP عالية الدقة.

بمجرد اكتمال التصوير ، تتم إزالة الدماغ من طبق P Two وتخزينه في BAB وحمايته من الضوء للتصوير في المستقبل. توضح الصور التمثيلية ومقاطع الفيديو المعروضة هنا قدرة التصوير الفوتوني المتعدد عالية الدقة التي أصبحت ممكنة من خلال المسح البصري. يسمح تصوير الدماغ بالكامل للخلايا العصبية الملصقة YFP في الطبقات المختلفة من الحصين والقشرة المخية الحديثة بأن تكون مرئية بوضوح بعمق يصل إلى ملليمترين تحت سطح الأنسجة.

نعرض هنا مقطع فيديو لمجموعة صور 1.2 ملم من التواء الفم بالكامل ، تم التقاطها من 0.8 إلى ملليمترين في الدماغ للكشف عن الطبقات التشريحية المختلفة للحصين. فيما يلي صورة تمثيلية لقسم إكليلي يبلغ طوله 1.94 ملم يسمى بيرغمان مأخوذة من صورة بعمق ملليمترين عالقة تم فيها تمييز الطبقات المختلفة من الحصين. من خلال تكبير القشرة المخية الحديثة ، يمكن تمييز المحاور الفردية وأجسام الخلايا العصبية للطبقة الخامسة من الخلايا العصبية الحلقية في القشرة المخية الحديثة بوضوح حتى 1.02 ملم تحت سطح الأنسجة.

نعرض هنا صورة عالقة للخلايا العصبية من الطبقة الخامسة مأخوذة بين 700 إلى 1020 ميكرون تحت سطح الأنسجة. فيما يلي صورة تمثيلية من هذا المكدس تم أخذها 774 ميكرون في الدماغ. باستخدام نفس مجموعة الصور ، تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمنطقة الخلايا العصبية باستخدام برنامج Image J.

لنا القدرة عالية الدقة للفحص المجهري متعدد الروبوتات أيضا بتقديم صور للخلايا العصبية الفردية بأكملها. نعرض هنا إعادة بناء خلية عصبية من الطبقة الخامسة من القشرة المخية الحديثة حيث تكون العمليات الجينية D مرئية بوضوح. يختتم هذا عرضنا للمسح البصري ، والتواء الفأر الكامل الذي يعبر عن YFP.

يعد إجراء هذه التقنية أمرا بسيطا نسبيا وكما أوضحنا ، يمكن استخدامه لعرض وتصوير العديد من المناطق والهياكل المختلفة للالتواء الماوس. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق.