Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

عادةً ما يقتصر المجهر متعدد الفوتونات للأنسجة المثبتة على أعماق اختراق ضحلة لا تتجاوز بضع مئات من الميكرونات. وقد أثبتنا مؤخراً أول استخدام للمجهر متعدد الفوتونات بعمق يصل إلى عدة مليمترات داخل أعضاء الفئران المثبتة باستخدام التصفية البصرية بمحلول من كحول البنزو وبنزوات البنزويل. وفي عرضنا التوضيحي الأولي، قامت هذه التقنية بتصوير الفلورة الذاتية للأنسجة.

ومع ذلك، هناك اهتمام متزايد باستخدام طرق التصفية الضوئية مع الأنسجة التي تعبر عن البروتينات الفلورية مثل GFP. نقدم هنا بروتوكولاً للمجهر متعدد الفوتونات لأنسجة الدماغ المصفاة باستخدام محلول benzo alcohol نفسه الذي يحافظ على فلورة البروتين الفلوري الأصفر الذي يتم التعبير عنه بواسطة محفز واحد في دماغ الفأر. أصبح التصوير عالي الدقة لعضو فأر كامل باستخدام المجهر متعدد الفوتونات ممكناً من خلال التصفية الضوئية للعضو قبل التصوير مقارنة بالتصوير بدون تصفية. Multiphoton.

يقتصر تصوير الدماغ على عمق 300 microns تحت سطح النسيج بسبب تأثيرات تشتت الضوء الناتجة عن الاختلافات في معاملات الانكسار بين الماء والبروتينات التي يتكون منها نسيج الدماغ. وللتغلب على هذا القيد، يتم تجفيف العضو واستبدال الماء بسائل له معامل انكسار مشابه لمعامل انكسار البروتينات المكونة للنسيج. تساعد عملية التصفية الضوئية هذه في تقليل تشتت الضوء بشكل كبير لتوفير تصوير أفضل على أعماق أكبر تحت سطح النسيج.

توضح الصور المقدمة من Batta وآخرون كيفية تطبيق هذه التقنية لعرض النسيج المرضي لأعضاء مختلفة من الفأر باستخدام الفلورة الذاتية وتوليد التوافق الثاني. هذه الصورة الأولى للخصية لدى الفأر، وقد التُقطت على عمق 1.4 millimeters تحت سطح النسيج. تتيح خاصية الدقة العالية للمجهر متعدد الفوتونات لنا التكبير والحصول على رؤية واضحة لخلايا الحيوانات المنوية الفردية التي تتكون في الأنابيب المنوية.

كما يظهر في أقصى اليمين هنا، نعرض صورة لرئة الفأر، والتي تم التقاطها أيضاً على عمق 1.4 millimeters تحت سطح النسيج. تُعد هذه الصورة نموذجاً للتصوير متعدد الفوتونات ثنائي القنوات، حيث تم وسم مكونات الإيلاستين باللون الأحمر بينما وسم الكولاجين باللون الأخضر، وعند التكبير يمكن تمييز الألياف الفردية بسهولة. وأخيراً، نعرض صوراً عالية الدقة للمناطق الداخلية من دماغ الفأر تم التقاطها على عمق 850 microns تحت سطح النسيج؛ ومن خلال التكبير على القشرة الحديثة والحصين في الدماغ، يمكن رؤية الخلايا النجمية وأجسام الخلايا العصبية الفردية بوضوح.

ومع ذلك، عند إجراء الترويق البصري للأعضاء التي يمكن أن تحتوي على بروتينات فلورية مثل YFP، فإن بروتوكول الترويق البصري الخاص بـ badra et al لا يحافظ على الإشارة الفلورية لهذه البروتينات الفلورية. يمثل البروتوكول المقدم هنا طريقة مبتكرة لإجراء الترويق البصري والتصوير للعضو الكامل لدماغ الفأر مع الحفاظ على الإشارة الفلورية لـ YFP والعصبونات؛ حيث وُجد أن تجفيف الدماغ باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول والترويق بمحلول بنسبة 1:2 من بنزيل الكحول وبنزوات البنزيل، والمعروف باسم BAB، يقلل من تلف البروتينات الفلورية ويحافظ على إشارتها الفلورية. وبالنسبة للتصوير متعدد الفوتونات، يتم أولاً وزن فئران YFP ثم تخديرها عن طريق حقن كيتامين زايلزين داخل الصفاق.

يجب التأكد من وصول الحيوان إلى مستوى التخدير الجراحي قبل البدء في العملية. ينبغي فحص الحيوان كل خمس دقائق لمعرفة ما إذا كان يستجيب لقرصة قوية في إصبع القدم أو الذيل. وإذا استجاب الحيوان، يلزم إعطاؤه جرعة تكميلية من ketamine xylazine.

بمجرد تخدير الفئران، يتم تثبيتها عن طريق لصق كل طرف على سرير جراحي باستخدام شريط لاصق مخبري بحيث يكون الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري مع كشف الصدر لإجراء الجراحة. للبدء، يتم إجراء شق تحت الناتئ الخنجري من أجل إجراء قطع على طول قاعدة القفص الصدري باستخدام مقص وملاقط لسحب الجلد أثناء إجراء القطع، ثم يتم إجراء قطعين على جانبي عظم القص لدى الفأر لإنشاء سديلة من الأنسجة يتم إبعادها عن تجويف الصدر باستخدام ملقط شرياني لترك القلب مكشوفاً. بعد ذلك، يتم إدخال إبرة قياس 23 في البطين الأيسر للقلب، ويتم إجراء شق صغير في الجدار العضلي للأذين الأيمن للسماح للدم بالخروج. فور قطع الأذين الأيمن، تبدأ عملية التروية باستخدام phosphate buffered saline بدرجة حرارة 4 °C حتى يتوقف تصريف الدم من الأذين الأيمن.

أثناء عملية التروية، تُستخدم مضخة 연동ية (peristaltic pump) ويتم ضبط قوة الضخ بحيث يندفع السائل لمسافة تتراوح من 1.5 إلى بوصتين بعيداً عن طرف الإبرة. وبمجرد تصريف جميع الدماء، يتم تحويل وسط التروية إلى محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4% عند درجة حرارة 4 °C حتى يصبح جسم الفأر صلباً ومتيبساً بشكل ملحوظ. وبعد التروية، يُرفع الفأر من سرير الجراحة ويتم فصل الرأس للبدء في استئصال الدماغ باستخدام الملاقط ومقص القزحية.

تتم إزالة الجمجمة على أقسام صغيرة بدءاً من الجزء الخلفي من الجمجمة والتحرك نحو الأمام. تُجرى شقوق صغيرة كل 2 إلى 4 مليمتر باستخدام المقص عبر الجمجمة، بينما تُستخدم الملاقط لسحب العظم بعناية بعيداً عن الدماغ في أقسام صغيرة، ويستمر ذلك حتى يتم كشف السطح العلوي بالكامل للدماغ. بعد ذلك، يتم استئصال الدماغ من الجمجمة باستخدام ملعقة جراحية، ويوضع في قارورة زجاجية تحتوي على 4% paraformaldehyde للتثبيت لمدة ست ساعات.

بينما ينصب تركيزنا الأساسي في هذا العرض التوضيحي على تصوير دماغ فأر يعبر عن YFP، سنقوم أيضاً بإجراء عملية الترويق البصري لفأر، وساق خلفية، ومقطع من أمعاء دقيقة لإظهار قدرات الترويق لهذا الإجراء بأفضل شكل ممكن. بعد التثبيت البعدي، يتم غسل الدماغ والأنسجة الأخرى مرتين في PBS. ثم يتم تجفيف عينات الأنسجة في درجة حرارة الغرفة من خلال سلسلة من عمليات الحضن في الإيثانول بتركيزات 50% 70% 90% و100% ethanol.

تستغرق كل فترة تحضين ساعتين، ثم يتم إجراء تحضين ثانٍ في إيثانول بتركيز 100% لمدة 12 ساعة لاستخلاص الماء بكفاءة من النسيج المثبت. بعد عملية نزع الماء، يتم سكب محلول الإيثانول 100% الأخير، وتُغمر عينات النسيج في محلول يتكون من الإيثانول وBAB بنسبة واحد إلى واحد لمدة ساعتين قبل غمرها في محلول BAB للتنقية بتركيز 100%.

بمجرد وضعها في محلول BAB، ستصبح عينات الدماغ والأنسجة الأخرى شفافة بشكل ملحوظ في غضون أربع إلى خمس ساعات. نعرض هنا مقطع فيديو بنظام التصوير الزمني (time-lapse) للساعات الست الأولى من عملية الترويق الضوئي. تشير علامة القفز إلى الوقت الذي تم فيه استبدال محلول الإيثانول إلى BAB بنسبة 1:1 بمحلول BAB بتركيز 100%.

في نهاية ست ساعات، تظهر جميع الأعضاء علامات على الشفافية، فعلى سبيل المثال، تصبح العظمة الموجودة في الساق الخلفية للفأر مرئية بوضوح الآن لتحقيق أفضل نتائج التصفية. يجب ترك الدماغ ليتم تصفيته لمدة ستة أيام في درجة حرارة الغرفة مع حمايته من الضوء الساطع. وبمجرد تصفية الدماغ وأصبح جاهزاً للتصوير، يتم تثبيته في قاع طبق بتري باستخدام Sano acrylic أو الغراء الفائق.

بعد جفاف الغراء، يتم غمر الدماغ في BAB وتوضع أطباق بتري تحت الشيئية من أجل التصوير. وللتصوير، نستخدم مجهرًا متعدد الفوتونات يشتمل على ليزر تيتانيوم ياقوتي MI tie يمكن ضبط طول موجة الإثارة فيه بين 710 إلى 990 nanometer. أما طول موجة الإثارة التي نستخدمها لتوليد إشارات YFP فهي 886 nanometers.

يتم بعد ذلك التقاط إشارة الفلوريسنت الانعكاسية باستخدام عدسة شيئية NIK icon five x التي تتيح التصوير بمجال رؤية واسع. وتتم تصفية إشارة الفلوريسنت الانعكاسية باستخدام مرشح تمرير نطاق 5 35 50 وجمعها باستخدام مضاعف فوتوني عالي الكفاءة الكمية من OMA Matsu. وتتم معالجة الصور باستخدام برنامج scan image بدقة 2048 by 2048 بكسل وبمعدل مسح يبلغ 2 milliseconds لكل خط لإنتاج صور عالية الدقة لبروتين YFP.

بمجرد اكتمال التصوير، يتم إخراج الدماغ من طبق P two وحفظه في BAB مع حجب الضوء عنه من أجل عمليات التصوير المستقبلية. توضح الصور ومقاطع الفيديو التمثيلية المعروضة هنا قدرة التصوير عالي الدقة باستخدام الفوتونات المتعددة والتي أصبحت ممكنة بفضل الترويق البصري. يتيح تصوير الدماغ الكامل رؤية العصبونات المحددة بـ YFP في الطبقات المختلفة من الحصين والقشرة الحديثة بوضوح على عمق يصل إلى two millimeters تحت سطح النسيج.

نعرض هنا مقطع فيديو لمجموعة صور بسماكة 1.2 مليمتر من عينة كاملة للفم، تم التقاطها على عمق يتراوح بين 0.8 إلى 2 مليمتر داخل الدماغ للكشف عن الطبقات التشريحية المختلفة للحصين. فيما يلي صورة نموذجية لمقطع إكليلي بسماكة 1.94 مليمتر تسمى Bergman، مأخوذة من مجموعة الصور ذات العمق 2 مليمتر، والتي تم فيها تحديد الطبقات المختلفة للحصين. ومن خلال التكبير على القشرة الحديثة، يمكن تمييز المحاور العصبية الفردية وأجسام الخلايا العصبية للخلايا الهرمية في الطبقة الخامسة من القشرة الحديثة بوضوح حتى عمق 1.02 مليمتر تحت سطح النسيج.

نعرض هنا مجموعة صور مكدسة لعصبونات الطبقة الخامسة تم التقاطها على عمق يتراوح بين 700 إلى 1020 ميكرون تحت سطح النسيج. فيما يلي صورة تمثيلية من تلك المجموعة تم التقاطها على عمق 774 ميكرون داخل الدماغ. وباستخدام مجموعة الصور نفسها، تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمنطقة العصبونات باستخدام برنامج Image J.

تتيح القدرة العالية على تحليل الدقة في مجهر multi bot لنا أيضاً تقديم صور لخلايا عصبية فردية كاملة. نعرض هنا إعادة بناء لخلية عصبية من الطبقة الخامسة في القشرة المخية الحديثة (neocortex) والتي تظهر فيها العمليات الجينية D بوضوح. بهذا نختتم عرضنا للتنقية البصرية للدماغ الكامل للفأر الذي يعبر عن YFP.

يعد تنفيذ هذه التقنية بسيطاً نسبياً، وكما أوضحنا، يمكن استخدامها لعرض وتصوير العديد من المناطق والهياكل المختلفة في الدماغ الفأري. شكراً لكم على المشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق.