استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة

يهدف هذا الاختبار إلى تقييم فعالية المضادات الحيوية ضد الأغشية الحيوية لبكتيريا pseudomonas Aerogen، في ظل ظروف تمثل العدوى المزمنة في رئة المصابين بالتليف الكيسي باستخدام وسط بلغم اصطناعي محدد. يتم تنمية الأغشية الحيوية البكتيرية في أطباق معايرة دقيقة ذات 24 بئراً.

تُعرَّض الأغشية الحيوية بعد ذلك للمضادات الحيوية. تالياً، يتم تفكيك المزارع المعالجة بالمضادات الحيوية باستخدام إنزيم السليولاز (cellulase)، ثم تُحضن مع صبغة استقلابية وهي صبغة srin، والتي تختزلها الخلايا الحية من اللون الأزرق إلى اللون الوردي. ومن خلال قياس امتصاصية الآبار، يمكن تحديد التركيز المثبط الأدنى للخلايا في الغشاء الحيوي B-S-M-I-C لتقدير مدى الحساسية للمضادات الحيوية تحت ظروف تقارب الظروف الفسيولوجية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحديد التركيزات المثبطة الدنيا بناءً على المزارع العالقة، في أن البكتيريا تنمو في وسط متخصص يحتوي على جميع مكونات البلغم، مما يعزز تكوين الغشاء الحيوي الرقيق. وتكون هذه الأغشية الحيوية الرقيقة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية. ولتحضير الوسط، قم أولاً بتجهيز زجاجتين تحتويان على 250 milliliters من الماء المعقم في الزجاجة الأولى.

أضف المحرك تدريجياً، ثم أضف أربعة جرامات من DNA نطاف الأسماك إلى 250 milliliters من الماء المعقم. حرّك المحلول في درجة حرارة الغرفة واترك DNA يذوب في الزجاجة الثانية. أضف تدريجياً خمسة جرامات من الميوسين من النوع الثاني المستخلص من معدة الخنزير وقم بالتحريك.

بمجرد تجهيز محاليل DNA والميوسين، يتم إذابة الأحماض الأمينية في 100 milliliters من الماء المعقم، باستثناء L tyrosine و L cysteine، اللذين يجب إذابتهما في 25 milliliters من الماء، أو 25 milliliters من potassium hydroxide بتركيز 0.5 molar على التوالي. بعد ذلك، يتم إذابة 5.9 milligrams من DTPA، وخمسة جرامات من sodium chloride و 2.2 grams من potassium chloride في 100 milliliters من الماء. تُخلط جميع المحاليل المختلفة في زجاجة سعة لتر واحد، ثم يُضاف خمسة milliliters من مستحلب صفار البيض، ويُستكمل حجم الخليط بالماء حتى يصل إلى 850 milliliters.

باستخدام محلول triss بتركيز مولار واحد، اضبط الـ pH إلى 6.9 وأكمل الحجم النهائي إلى لتر واحد باستخدام الماء. ولتعقيم الوسط، قم بترشيحه باستخدام مضخة تفريغ ذات غشائين من العلامة التجارية vacuum brand ME ووحدة ترشيح Millipore stereo top بفتحة قطرها 45 millimeter وحجم مسام 0.2 micron. يمكن إجراء عملية الترشيح على مدار يومين. ويمكن تخزين وسط A SM في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد.

ابدأ بتخفيف مزارع *Pseudomonas aroma* التي نمت طوال الليل في وسط LB للحصول على كثافة ضوئية OD تبلغ 0.05. بعد ذلك، قم بتخفيف البكتيريا بنسبة 1 إلى 100 في طبق يحتوي على وسط SM، وبمعدل 1.8 milliliters لكل بئر من المزرعة البكتيرية المخففة في 21 بئراً من طبق زراعة أنسجة يحتوي على 24 بئراً. أضف نفس الحجم من وسط SM في الآبار الثلاثة المتبقية، والتي ستعمل كضوابط سلبية فارغة. قم بإحكام إغلاق الطبق ذو الـ 24 بئراً، وللسماح بتشكل الغشاء الحيوي (biofilm)، ضعه تحت ظروف هوائية دقيقة (microaerophilic)، والتي يمكن تحقيقها باستخدام حزم توليد الغاز CampiGen في جرات لاهوائية كبيرة.

قم بتحضين المزرعة على هزاز مضبوط عند 75 RPM لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية؛ وبعد ثلاثة أيام، ستظهر الأغشية الحيوية ككتلة هلامية تحتوي على خلايا بكتيرية ولا يمكن تفكيكها عن طريق السحب بالممصّة. وبمجرد تشكل الأغشية الحيوية، أضف 200 microliters لكل بئر من المضاد الحيوي بتركيزات مخففة تسلسلياً. تأكد من إعداد أربع مكررات على الأقل لكل تركيز دواء سيتم اختباره، وترك أربعة آبار تحتوي على أغشية حيوية بدون معالجة لاستخدامها كمجموعات ضابطة سلبية.

بعد ذلك، يتم تحضين الأطباق مسبقاً لمدة 24 ساعة إضافية بعد التحضين مع المضادات الحيوية. استخدم 100 µL من إنزيم السليولاز لكل بئر، مخففاً بتركيز 100 mg/mL في محلول منظم السيترات لتفكيك الأغشية الحيوية، ثم يتم تحضين الأطباق على جهاز هزاز مضبوط على 150 RPM تحت ظروف هوائية عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد انتهاء هذه الفترة من التحضين، يمكن استخدام الماصة يدوياً لزيادة تفكيك الأغشية الحيوية في حال ظهور تكتلات خلوية في الوسط.

بعد ذلك، أضف 100 µL من كاشف resazin لكل بئر لتقدير حيوية الخلايا المتحررة من الغشاء الحيوي (biofilm)، واترك الخلايا لتتحضن لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. عند درجة حرارة 37 °C، تستطيع الخلايا الحيوية فقط استقلاب صبغة resazin الزرقاء وتحويلها إلى شكلها الفلوري الوردي. بعد انتهاء فترة التحضين، انقل العينات إلى طبق معايرة مكون من 96 بئر، وقم بقياس الفلورة في الآبار باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 540 nm وطول موجي للانبعاث يبلغ 590 nm.

من أجل قياس حيوية البكتيريا وقابلية التأثر بالعقار، قم أولاً بطرح الفلورة الخلفية للعينة الضابطة الفارغة من الآبار الأخرى. بعد ذلك، احسب نسبة التثبيط بقسمة متوسط الفلورة لكل تركيز على متوسط الفلورة للعينات الضابطة غير المعالجة والضرب في 100. يُعرَّف B-S-M-Y-C بأنه تركيز المضاد الحيوي الذي يسبب تثبيطاً بنسبة 90% للنشاط الأيضي؛ وكما يظهر في هذه الصور المجهرية الإلكترونية، تختلف الخلايا التي نمت في الأغشية الحيوية بشكل كبير عن البكتيريا التي نمت في المزارع العالقة.

على وجه الخصوص، تحيط كميات كبيرة من المادة الخلالية خارج الخلية الموضحة باللون الأصفر بالخلايا في الغشاء الحيوي الموضح باللون الأخضر، وهو ما لا يظهر في المستعمرات العائمة. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون البكتيريا في الأغشية الحيوية أكثر مقاومة للمضادات الحيوية في هذه التجربة. وقد تم تحديد التركيز المثبط الأدنى للتوبرايميسين لمزرعة Pseudomonas aerogen العائمة الموضحة باللون الأزرق بنحو 4 µg/mL.

وفي المقابل، وكما هو موضح باللون الأحمر، نجت 100% من البكتيريا في الأغشية الحيوية حتى تركيز 512 micrograms per milliliter من المضاد الحيوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع البكتيريا في وسط بلغم اصطناعي محدد. كما يجب أن تكون قادراً على إجراء اختبار حساسية للمضادات الحيوية لتحديد التركيز المثبط الأدنى المطلوب لتثبيط النمو البكتيري في بيئة أكثر واقعية لمحاكاة رئة المصاب بالتليف الكيسي.