الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)
مايو 16, 2012
الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل في الوقت الحقيقي (qPCR) هو وسيلة سريعة وحساسة للتحقيق في مستويات التعبير عن مختلف microRNA (ميرنا) الجزيئات في عينات الورم. ويمكن استخدام هذا التعبير أسلوب مئات من جزيئات ميرنا مختلفة يتم تضخيمها، كميا، وتحليلها من القالب نفسه [كدنا].
الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مستويات التعبير عن جزيئات الحمض النووي الريبي الدقيقة في سرطان البروستاتا وأنسجة البروستاتا الطبيعية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي الكلي أولا من أنسجة البروستاتا. يتضمن ذلك السيد NA micro RNA والحمض النووي الريبي الصغير الآخر.
بعد ذلك ، يتم عكس الحمض النووي الريبي لنسخ CDNA. ثم يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي القائم على الإنترنت الأخضر باستخدام CD NA كقالب لتضخيم وتحديد تعبير الحمض النووي الريبي الجزئي في الوقت الفعلي. تم الحصول على النتائج التي تظهر التعبير النسبي عن microRNAs في عينات البروستاتا المختلفة بناء على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى هي أنها توفر حساسية كبيرة ودقة وقابلية للتكرار ، كما أنها سريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان حيث غالبا ما يرتبط تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بالجينات التي تشارك بشكل كبير في عملية السرطان. لذلك يمكننا استخدام QPCR لتقييم التعبير عن microRNAs ومعرفة كيف يرتبط ذلك بالمتغيرات السريرية.
يمكن استخدام هذه المؤشرات الحيوية كأدوات تشخيصية وتنبؤية. قد تساعدنا في تشخيص سرطان البروستاتا وكذلك تساعدنا في تحديد سرطانات البروستاتا العدوانية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك احتمال أن تكون هذه المؤشرات الحيوية عوامل علاجية.
لا يمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة لتكوين ورم البروستاتا فحسب ، بل يمكن تطبيقها أيضا على أنواع السرطان والأمراض الأخرى. اجمع عينات البروستاتا في وقت استئصال الخارج وقم بتوجيه العينة باستخدام المعالم التشريحية. قم بطلاء البروستاتا والحويصلات المنوية على النحو التالي ، الجانب الأيمن الأخضر ، الجانب الأيسر الأزرق.
خذ قسما وسطيا عرضيا عشوائيا من الأنسجة عموديا على سطح المستقيم ، وقم بتجميد العينة وتخزينها سالب 80 درجة مئوية. خذ نسخة ضوئية وقم بتوجيه شرائح العينات وقسمها إلى أربعة أجزاء متساوية. استشر أخصائي علم الأمراض لتحديد الورم مقابل المناطق الطبيعية في الصورة المقابلة.
استخدم المناطق المحددة كدليل لتحديد أنسجة الورم لاستخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي. ابدأ بوضع عينات البروستاتا المجمدة على الثلج الجاف والرجوع إلى النسخة المصورة. قطع جزء صغير من ورم البروستاتا.
تجانس أنسجة ورم البروستاتا في مليلتر واحد من كاشف التريول. احتضان العينات المتجانسة لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف 0.2 مل من الكلوروفورم إلى العينات ورجه بقوة لمدة 15 ثانية.
احتضان العينات لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 12،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المرحلة المائية العلوية عديمة اللون إلى أنابيب جديدة وأضف 0.5 مل من كحول الأيزوبروبيل. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم جهاز الطرد المركزي 12 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
استنشق المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي. أضف ملليلتر واحد من 75٪ من الإيثانول إلى دوامة حبيبات الحمض النووي الريبي ، والعينة والرواسب عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 7 ، 500 مرة G عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، قم بشفط SNAT وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي لمدة خمس إلى 10 دقائق ، مع التأكد من أنها ليست جافة تماما.
أحمر, قم بإذابة الحبيبات في الماء الخالي من النوكلياز واستخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. استخدم محللا حيويا للتحقق من جودة عينات الحمض النووي الريبي وسلامتها. قم بنسخ الحمض النووي الريبي العكسي إلى CDNA باستخدام مجموعة نسخ عكسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لإنشاء منحنى قياسي ، قم بإعداد سلسلة من التخفيف من القرص المضغوط NA الأصلي من عينة معروفة بأنها تحتوي على تعبير جوهري عن الجين محل الاهتمام. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي عن طريق إعداد مزيج رئيسي يعتمد على حجم تفاعل 20 ميكرولتر من اثنين × كم. اكتشف مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخضر السيبراني 10 × برايمر عالمي مصغر ، ومقايسة تمهيدية 10 × ميكروسكربت ومياه مجانية من RN a.
قم بتضمين مجموعتين من البادئات ، واحدة للجين المستهدف والأخرى للجين المرجعي في هذه الحالة ، RNU ستة B.Pipette ميكرولتر من كل تخفيف CDNA في أنابيب شعرية فردية للتدوير الخفيف ، وأضف 18 ميكرولترا من المزيج الرئيسي. استخدم محول شعري لأجهزة الطرد المركزي. ضع الشعيرات الدموية في جهاز تدوير في الوقت الفعلي قائم على الشعيرات الدموية وقم بتشغيل برنامج PCR على النحو التالي ، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعة ب 50 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 70 درجة مئوية. لمدة 30 ثانية، حدد عينة لتكون المعايرة وقم بتعيين المبلغ المستهدف الطبيعي إلى واحد. قارن التعبير النسبي للحمض النووي الريبي الصغير في جميع العينات الأخرى بجهاز المعاير لإنشاء منحنيات تضخيم.
بالنسبة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم الإصدار 3.5 من برنامج التدوير الخفيف للكيميويات الحيوية الجزيئية في علامة تبويب القياس الكمي. حدد التفاعلات وقم بتصدير البيانات إلى ملف نصي. قم باستيراد البيانات إلى برنامج التحليل الكمي REL لإنشاء نتائج القياس الكمي.
استيراد ملفات منفصلة للجين المستهدف والجين المرجعي وبيانات المنحنى القياسية. حدد موضع المعاير لكل من الجين المستهدف والمرجعي ، بالإضافة إلى مواضع العينات. يتم التعبير عن البيانات كنسبة الهدف إلى المرجع للعينات المختلفة مقسومة على النسبة المستهدفة إلى المرجعية للمعاير.
استخدم المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقا لجين RNA صغير معين وجين التدبير المنزلي كمعيار مرجعي لاستقراء البيانات الكمية للحمض النووي الريبي الصغير. أهداف تركيزات غير معروفة. قم بتحليل ثلاث عينات كمجموعة واحسب متوسط التركيزات والانحرافات المعيارية للتكرار الثلاثي.
إذا كان أحد النسخ الثلاثية غير متسق مع بقية المجموعة ، فسيقوم البرنامج باستبعاده. يظهر هنا مثال على تحليل A-Q-P-C-R لعينات البروستاتا. تبدأ الرسوم البيانية التي توضح مستويات التعبير عن الجين المرجعي U six في التضخيم الأسي في حوالي الدورة 20 بينما أظهر التعبير عن الجين المستهدف ، MIR 98 تضخيما متأخرا حول الدورة 25.
تم تصدير البيانات من هذه التجربة كملف نصي وتحليلها بواسطة مواضع برنامج تحليل requ للشعيرات الدموية التي تحتوي على المعاير والعينات. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم واحد عند إجراؤها بشكل صحيح. تعتمد موثوقية هذه التقنية على جودة الحمض النووي
الريبي.لذلك ، من المهم توخي الحذر الشديد في التعامل مع الحمض النووي الريبي لأنه يمكن أن يتحلل بسهولة بالغة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) لقياس مستويات التعبير عن microRNA في سرطان البروستاتا والأنسجة الطبيعية للبروستاتا. تتيح هذه الطريقة تضخيم وتحديد كمية مختلف جزيئات miRNA من نفس قالب cDNA.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- علم الأحياء الجزيئي
الخلفية
- تلعب microRNAs دورًا مهمًا في تنظيم الجينات.
- سرطان البروستاتا يمثل مصدر قلق صحي كبير.
- فهم التعبير عن miRNA يمكن أن يوفر رؤى حول بيولوجيا السرطان.
- qPCR هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتحليل التعبير الجيني.
غرض الدراسة
- لتحديد كمية مستويات التعبير عن microRNA في أنسجة سرطان البروستاتا.
- لمقارنة مستويات miRNA بين الأنسجة السرطانية والأنسجة الطبيعية للبروستاتا.
- لاستخدام qPCR لتحليل حساس وسريع لـ miRNA.
الطرق المستخدمة
- استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من أنسجة البروستاتا.
- النسخ العكسي لتوليد cDNA.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام Cyber Green للتضخيم.
- تحديد كمية التعبير عن microRNA في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- تم تحديد مستويات التعبير النسبية لـ microRNAs المختلفة.
- تمت ملاحظة اختلافات في التعبير عن miRNA بين الأنسجة السرطانية والأنسجة الطبيعية.
- تسلط النتائج الضوء على إمكانات miRNAs كمؤشرات بيولوجية لسرطان البروستاتا.
- أثبت qPCR فعاليته في تحليل العديد من miRNAs في وقت واحد.
الاستنتاجات
- qPCR هو أداة قيمة لدراسة التعبير عن microRNA في أبحاث السرطان.
- قد تساهم النتائج في فهم بيولوجيا سرطان البروستاتا.
- هناك حاجة إلى مزيد من البحث لاستكشاف الأدوار الوظيفية لـ miRNAs المحددة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR (qPCR) for microRNA detection in prostate tumors enables sensitive, reproducible quantification of miRNA expression, supporting early biomarker discovery and target validation. This workflow addresses the need for robust, quantitative molecular readouts in oncology R&D, facilitating risk-adjusted decisions at the discovery and translational interface. Reliable miRNA quantification underpins portfolio triage and informs mechanistic de-risking in cancer research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of miRNA involvement in oncogenic pathways.
- Supports functional target validation by correlating miRNA expression with clinical variables.
- Facilitates mechanistic de-risking through precise measurement of regulatory RNA species.
- Provides data for prioritizing candidate biomarkers in early-stage oncology programs.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative assays for miRNA detection in clinical and preclinical samples.
- Standardizes normalization using reference genes to ensure reproducibility across experiments.
- Enables scalable, high-throughput screening of miRNA expression profiles.
- Supports assay transferability to other tissue types and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA quantification with clinical sample analysis for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by using archived and fresh samples.
- Provides quantitative endpoints for evaluating disease relevance of candidate miRNAs.
- Reduces translational risk by enabling robust cross-sample comparisons.
Pipeline & Workflow Integration
This qPCR-based miRNA quantification method integrates from early discovery through translational research, supporting lead identification and preclinical validation in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory mechanisms and supports hypothesis-driven target selection.
- Screening: Standardized qPCR assays enable reproducible, quantitative readouts for compound or biomarker screening.
- Analytics: Relative quantification and normalization provide actionable data for comparing tumor and normal samples.
- Translational Research: Method accommodates both fresh and archived clinical samples, supporting biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Assay design and normalization strategies are adaptable across tissue types and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in miRNA-based target validation and biomarker discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for molecular quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate biomarkers and therapeutic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and qPCR assay design.
- Demands high-quality instrumentation for RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time PCR.
- Necessitates rigorous normalization and reference gene selection for cross-sample comparability.
- Adaptable to various tissue types and archived clinical specimens with appropriate validation.
- RNA integrity and sample handling are critical to data reliability and reproducibility.
