الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد وقياس مستويات تعبير جزيئات الـ micro RNA في أنسجة سرطان البروستاتا وأنسجة البروستاتا الطبيعية باستخدام تقنية quantitative real-time PCR. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخلاص الـ RNA الكلي أولاً من أنسجة البروستاتا، وهو ما يشمل الـ Mr NA والـ micro RNA وأنواعاً أخرى من الـ RNAs الصغيرة.

بعد ذلك، يتم إجراء النسخ العكسي للـ RNA لإنتاج cDNA. ثم يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) القائم على صبغة cyber green باستخدام الـ cDNA كقالب لتضخيم وقياس تعبير microRNA في الوقت الحقيقي. ويتم الحصول على نتائج توضح التعبير النسبي لـ microRNAs في عينات بروستاتا مختلفة بناءً على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى في أنها توفر حساسية ودقة وقابلية تكرار عالية، كما أنها سريعة وفعالة من حيث التكلفة. ويمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة محورية في مجال بيولوجيا السرطان، حيث يرتبط تعبير microRNA غالبًا بالجينات المشاركة بقوة في عملية السرطان. وبناءً على ذلك، يمكننا استخدام QPCR لتقييم تعبير microRNAs ومعرفة مدى ارتباط ذلك بالمتغيرات السريرية.

يمكن استخدام هذه المؤشرات الحيوية كأدوات تشخيصية وإنذارية على حد سواء؛ إذ قد تساعدنا في تشخيص سرطان البروستاتا، وكذلك في تحديد أنواع سرطان البروستاتا العدوانية. بالإضافة إلى ذلك، هناك إمكانية لاستخدام هذه المؤشرات الحيوية كعوامل علاجية.

لا تقتصر فائدة هذه الطريقة على توفير رؤى حول نشأة أورام البروستاتا فحسب، بل يمكن تطبيقها أيضاً على سرطانات وأمراض أخرى. يتم جمع عينات البروستاتا وقت عملية الاستئصال، وتوجيه العينة باستخدام المعالم التشريحية. تُصبغ البروستاتا والحويصلات المنوية كما يلي: الجانب الأيمن باللون الأخضر، والجانب الأيسر باللون الأزرق.

خذ مقطعاً عرضياً عشوائياً من منتصف النسيج بشكل عمودي على سطح المستقيم، ثم قم بتجميد العينة وتخزينها في درجة حرارة 80- °C. التقط صورة فوتوغرافية وحدد اتجاه شرائح العينات وقسمها إلى أربعة أجزاء متساوية. استشر أخصائي علم الأمراض لتحديد المناطق الورمية مقابل المناطق الطبيعية في الصورة المقابلة.

استخدم المناطق المحددة كدليل لتعريف أنسجة الورم لاستخلاص RNA من أجل عزل RNA. ابدأ بوضع عينات البروستاتا المجمدة على الثلج الجاف والرجوع إلى النسخة المصورة المحددة. قم بقص جزء صغير من ورم البروستاتا.

قم بتجانس نسيج الورم البروستاتي في واحد milliliter من كاشف triol. حضن العينات المتجانسة لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، أضف 0.2 milliliter من الكلوروفورم إلى العينات ورجها بقوة لمدة 15 ثانية.

يُحضضن العينات لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم إجراء الطرد المركزي بسرعة 12, 000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. يُنقل الطور المائي العلوي عديم اللون إلى أنابيب جديدة ويُضاف 0.5 milliliters من الكحول الإيزوبروبيلي. تُحضضن العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم إجراء الطرد المركزي بسرعة 12, 000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

قم بشفط السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب الذي يحتوي على الـ RNA. أضف 1 mL من الإيثانول بتركيز 75% إلى راسب الـ RNA، ثم قم بمزج العينة بجهاز vortex وترسيبها عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 7,500 ×g في درجة حرارة 4 °C. قم بشفط السائل الطافي مرة أخرى وتجفيف راسب الـ RNA لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، مع التأكد من عدم جفافه تماماً.

قم بإذابة الراسب في ماء خالٍ من النوكلييز، واستخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز الـ RNA. استخدم جهاز Bioanalyzer للتحقق من جودة وسلامة عينات الـ RNA. قم بإجراء النسخ العكسي للـ RNA إلى cDNA باستخدام طقم النسخ العكسي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

لإنشاء منحنى قياسي، قم بتحضير سلسلة من تخفيفات الـ CD NA الأصلية من عينة معروفة بأنها تحتوي على تعبير كبير للجين المستهدف. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) عن طريق تحضير مزيج رئيسي (master mix) بناءً على حجم تفاعل قدره 20 µL من 2 x quant. Detect cyber green PCR master mix و 10 x microscript universal primer و 10 x microscript primer assay وماء خالٍ من RN a's.

أضف مجموعتين من البادئات، إحداهما للجين المستهدف والأخرى للجين المرجعي وهو في هذه الحالة RNU six B. انقل باستخدام الماصة 2 µL من كل تخفيف لـ CDNA إلى أنابيب شعرية منفصلة لجهاز light cycler، وأضف 18 µL من الخليط الرئيسي (master mix). استخدم محول الأنابيب الشعرية لإجراء عملية الطرد المركزي. ضع الأنابيب الشعرية في جهاز realtime cycler يعتمد على الأنابيب الشعرية، وقم بتشغيل برنامج PCR وفقاً لما يلي: 95 °C لمدة 15 دقيقة، تليها 50 دورة عند 94 °C لمدة 15 ثانية.

درجة حرارة 55 °C لمدة 30 ثانية، ثم 70 °C لمدة 30 ثانية. اختر عينة لتكون المعاير وقم بتعيين مقدار الهدف المعياري لها ليكون واحداً. قارن التعبير النسبي لـ micro RNA في جميع العينات الأخرى بالنسبة للمعاير لإنشاء منحنيات التضخيم.

بالنسبة لتفاعلات PCR، استخدم برنامج molecular biochemicals light cycler الإصدار 3.5 في علامة تبويب الكميّة (quantification). قم بقياس كمية التفاعلات وتصدير البيانات إلى ملف نصي. ثم استورد البيانات إلى برنامج تحليل REL quant لإنتاج نتائج القياس الكمي.

قم باستيراد ملفات منفصلة لبيانات الجين المستهدف، والجين المرجعي، ومنحنى القياس. حدد موقع العينة المعايرة (calibrator) لكل من الجين المستهدف والمرجعي، بالإضافة إلى مواقع العينات. يتم التعبير عن البيانات كنسبة الجين المستهدف إلى المرجعي للعينات المختلفة مقسومة على نسبة الجين المستهدف إلى المرجعي للعينة المعايرة.

استخدم المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقاً لـ micro RNA معين وجين تدبير منزلي كمعيار مرجعي لاستقراء البيانات الكمية لـ micro RNA. استهدف عينات ذات تركيزات غير معروفة. قم بتحليل ثلاث عينات كمجموعة واحدة، واحسب متوسط التركيزات والانحرافات المعيارية للعينات الثلاث المكررة.

إذا كانت إحدى العينات الثلاث المكررة غير متوافقة مع بقية المجموعة، فسوف يستبعدها البرنامج. يظهر هنا مثال لتحليل A-Q-P-C-R لعينات من البروستاتا. وتظهر الرسوم البيانية التي توضح مستويات تعبير الجين المرجعي U six بدء التضخيم الأسي عند الدورة 20 تقريبًا، بينما أظهر تعبير الجين المستهدف، MIR 98 تضخيمًا متأخرًا حول الدورة 25.

تم تصدير البيانات من هذه التجربة كملف نصي وتحليلها بواسطة برنامج تحليل متخصص، حيث يتم تحديد مواضع الشعيرات التي تحتوي على المعاير والعينات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في يوم واحد عند تنفيذها بشكل صحيح. وتعتمد موثوقية هذه التقنية على جودة RNA.

لذلك، من المهم توخي عناية فائقة عند التعامل مع RNA نظراً لإمكانية تحلله بسهولة شديدة.