إعداد الخلايا متعلق بالنخاع الشوكي المكثف المشتقة (MDSC) من الفئران الحاملة للورم ساذجة والبنكرياس باستخدام التدفق الخلوي والفرز الآلي المغناطيسي خلية المنشط (AutoMACS)

الهدف العام من التجربة التالية هو التوليد السريع لمجموعة من الكريات البيضاء المخصبة والموجبة لـ GR one والتي تحتوي على خلايا كابتة مشتقة من النخاع (MDSCs) تكون قابلة للحياة من طحالب الفئران، وذلك لاستخدامها في مقاييس داخل الجسم (in vivo) وخارجه (in vitro). أولاً، يتم تجميع الطحالب من عدة فئران ومعالجتها لتوليد معلق من الخلايا المفردة. ولتقدير النسبة المئوية لخلايا MDSC قبل عملية الإخصاب، يتم نقل كمية صغيرة من الخلايا المجمعة إلى طبق بـ 96 بئراً ذات قاع على شكل حرف V.

يتم وسم المستضدات السطحية MAC one و GR one، ثم تُنقل الخلايا الموشومة إلى أنابيب fax لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. وتُصبغ بقية الكريات البيضاء المجمعة باستخدام جسم مضاد مقترن بصبغة فلورية ضد GR one، ثم تُحضن مع حبيبات مغناطيسية دقيقة ترتبط بالفلوروكروم الموجود على الجسم المضاد anti GR one. بعد ذلك، يتم فصل المجموعات الإيجابية لـ GR one والمجموعات السلبية لـ GR one باستخدام فاصل AutoMax pro لتقييم مدى نجاح إثراء GR one في هذه المجموعة.

تُؤخذ عينة صغيرة ويتم تحليلها للكشف عن تعبير GR one و MAC one لتقييم نسب الخلايا الكابتة المشتقة من النخاع (MDSC). ويُظهرت مقارنة بيانات التنميط المناعي الناتجة زيادة في نسب MDSC في مجموعة الكريات البيضاء المخصبة بـ GR one مقارنة بالمجموعة غير المخصبة. بالإضافة إلى ذلك، هناك زيادة في MDSC الساذجة، مما ينتج عنه مجموعة تضاهي MDSC الموجودة في الأورام.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التلوين التدفقِي التقليدي والفرز المعتمد على قياس التدفق الخلوي عالي السرعة لخلايا m DSCs من الأنسجة اللمفاوية، في أن تقنية المزيج الرئيسي (master mix) الخاصة بنا تمنع التباين الملحوظ في نتائجنا من خلال ضمان تلوين سطحي متساوٍ لمجموعة الكريات البيضاء، وتنميط foren وفرز AutoMax لخلايا m DSCs والخلايا الموجبة لـ GR one على التوالي. ستقوم بشرح الإجراءات نادين نيلسون، طالبة دراسات عليا من مختبرنا، والدكتور هاوسرا، مدير مرفق قياس التدفق الخلوي المركزي في جامعة جنوب فلوريدا (USF). يجب تنفيذ الإجراء التالي في بيئة معقمة تحت غطاء السلامة البيولوجية، مع الحفاظ على الخلايا والأجسام المضادة مبردة على الثلج.

قم بتجميع منخل تفكيك الخلايا كلما أمكن ذلك عن طريق إدخال الشبكة السلكية في فتحة الكوب باتجاه القاع. بعد ذلك، أدخل حلقة التثبيت في المنطقة المسننة بحيث يكون الجانب المزود بفتحة متجهًا للأعلى، واستخدم مفتاح الحلقة لإحكام ربط حلقة التثبيت لتأمين الشبكة. ضع المنخل المجمع في طبق بتري يحتوي على 10 milliliters من محلول XPBS.

تؤخذ الطحال من فئران C 57 black six، سواء كانت حاملة للأورام أو مجموعة ضابطة سليمة، وتتراوح أعمارها بين ستة إلى ثمانية أسابيع، وتوضع في المصفاة السلكية المخصصة لفصل الخلايا. بعد ذلك، تُستخدم مدقة زجاجية لسحق الطحال عبر المصفاة السلكية داخل طبق بتري. تكرر هذه العملية لكل مجموعة علاجية من الفئران.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة سيرولوجية سعة خمسة ملليلتر، ضع معلق الخلايا على مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرون واتركه يتصفي في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق. تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب بإضافة خمسة ملليلتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) لكل طحال مع السحب والدفع بالماصة بقوة، ثم حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد فترة التحضين، أوقف التفاعل بإضافة 20 ملليلتر من PBS مع السحب والدفع بالماصة بقوة.

بعد ذلك، يتم إجراء الطرد المركزي بسرعة 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق، ثم تُزال المادة الطافية، ويُعاد تعليق الراسب في 20 milliliters من محلول PBS المعقم ويتم عد الخلايا. وباستخدام صبغة tripan blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer)، يتم إعادة تعليق الخلايا بتركيز 1 × 10⁷ إلى 2 × 10⁷ خلية لكل milliliter في وسط صبغ بتركيز 3%. ويعد تحقيق الصبغ الأمثل هو الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء.

يمكن تنفيذ ذلك بنجاح عن طريق معايرة الأجسام المضادة مسبقاً. استخدم تحضير الخلطات الرئيسية والصبغ السطحي بأحجام صغيرة كما هو موضح في هذا البروتوكول. لصبغ الخلايا من أجل تحليل قياس التدفق الخلوي، قم بتمييز آبار لوحة vbo ذات الـ 96 بئراً للعينات الضابطة والتجريبية والصبغات الفردية.

بالنسبة لضوابط التعويض، أضف من 5×10⁵ إلى 1×10⁶ خلية في 50 µL إلى كل بئر من الآبار المحددة. ثم قم بطرد اللوحة مركزياً عند 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق، وبعد عملية الطرد المركزي، قم بمعاينة اللوحة من الأسفل.

تحقق من وجود الكريات في الآبار، ثم قم بتحضير خليط رئيسي من سدادات BDFC للفئران تحتوي على جسم مضاد أحادي النسيلة من جرذ ضد CD 1632 للفئران، مخففاً في وسط تلوين بتركيز 3% في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter على الثلج مع استخدام جهاز الفورتكس. بعد ذلك، قم بإجراء طرد مركزي قصير لمدة خمس ثوانٍ مع إمساك لوحة ذات 96 بئراً ذات قاع على شكل V فوق حاوية نفايات أو حوض غسيل. اقلب اللوحة بسرعة لأسفل ثم لأعلى مرة أخرى لإزالة السائل الطافي دون تشتيت كريات الخلايا.

ثم أضف 50 µL من المزيج الرئيسي لحصار مستقبلات FC (FC block master mix) إلى جميع الرواسب في لوحة ذات 96 بئراً ذات قاع على شكل V، مع الخلط عن طريق السحب والدفع اللطيف بالممصّة. ضع اللوحة على الثلج واتركها لتحضن لمدة 15 دقيقة في الظلام، ثم قم بطرد اللوحة مركزياً عند 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق. قم بتحضير مزيج رئيسي من أجسام Mac 1 و GR 1 المضادة لـ APC والمخففة في وسط تلوين بتركيز 3% في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL على الثلج.

قم بالرج الدوامي (Vortex) ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة خمس ثوانٍ. بعد عملية الطرد المركزي، اقلب الطبق لإزالة السائل الطافي من كل بئر، ثم أضف 50 µL من خليط الأجسام المضادة إلى الرواسب الضابطة أو التجريبية. امزج المكونات جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة. وبالنسبة لتعويضات الصبغة الواحدة، أضف 50 µL من MAC one F GR one A PC أو DPI المخفف في وسط صبغ بتركيز 3% إلى الآبار المناسبة. أما بالنسبة لعينة الضبط غير المصبوغة، فأضف 50 µL من وسط صبغ بتركيز 3% إلى البئر المناسب ثم امزجه.

بعد ذلك، يتم تحضين اللوح لمدة 30 دقيقة في الظلام على الثلج. وخلال فترة التحضين، يتم تمييز أنابيب الـ fax لتتوافق مع كل بئر في اللوح، وإضافة 200 µL من وسط التلوين بتركيز 3% إلى كل أنبوب fax. وبعد انتهاء فترة التحضين التي مدتها 30 دقيقة، يتم طرد اللوح مركزياً عند 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السوائل الطافية كما في الخطوات السابقة. بعد ذلك، اغسل الرواسب بإضافة 100 µL من وسط الصبغ بتركيز 3% إلى كل راسب. اخلط جيداً عن طريق السحب والدفع اللطيف باستخدام الماصة.

قم بطرد الطبق مركزياً مرة أخرى لمدة خمس دقائق. كرر خطوة الغسل مرة واحدة بعد عملية الطرد المركزي، ثم تخلص من مادة natin كما سبق، وأعد تعليق كل راسب في 100 µL من وسط تلوين بتركيز 3% واخلط جيداً. بعد ذلك، انقل 100 µL من الخلايا المعاد تعليقها من كل بئر في الطبق إلى أنبوب fax المسمى المقابل لها.

بعد ذلك، أضف 75 nanograms per milliliter من DPI إلى العينات الضابطة والتجريبية وإلى ضابط تعويض الصبغ المنفرد بـ DPI. قم بإجراء عملية الحصول على البيانات السيتومترية لتحديد نسب MDSC كما هو موضح في المستند المرفق، ثم قم بإثراء GR one positive leukocytes بمقدار 1 × 10⁷ من بقية الكريات البيضاء غير المصبوغة في أنابيب fax مُصنفة بشكل مناسب، وقم بطردها مركزياً عند 250 to 300 ×g لمدة خمس دقائق. أضف 50 µL من تخفيف بنسبة 1:10 من جسم مضاد GR one PE في محلول max buffer، ثم حضّن العينات لمدة 15 دقيقة عند 4 °C في الظلام.

بعد انتهاء فترة الحضانة، أضف 2 ml من max buffer إلى كل أنبوب fax، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق. وبعد الانتهاء من عملية الطرد المركزي، تخلص من الراشح. بعد ذلك، أضف 200 µL من تخفيف بنسبة 1:4 من anti PE microbeads في max buffer إلى كل أنبوب، واتركها للحضانة لمدة 15 دقيقة عند 4 °C في الظلام.

أضف 2 mL من max buffer إلى أنابيب fax، ثم قم بالطرد المركزي عند 250 إلى 300 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في 3 mL من staining buffer، ثم قم بالترشيح عبر مصفاة ذات مسام بحجم 70 micron في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 mL وموسوم. في هذا البروتوكول، نستخدم الفصل المغناطيسي التلقائي.

يعد الفصل المغناطيسي خياراً ممتازاً من بين طرق الفصل. فإذا كنت بحاجة إلى فصل عدد كبير من الخلايا بسرعة وبتكلفة فعالة، وبناءً على مؤشر سطحي، فاحرص على التحقق من نتائجك في النهاية باستخدام قياس التدفق الخلوي. ولتحضير وتهيئة جهاز الفصل AutoMax pro، تأكد من ملء جميع الزجاجات بالمحاليل المناسبة.

قم بتشغيل الجهاز. ثم بعد التهيئة، افحص حالة حاويات السوائل والأعمدة. يجب أن تكون جميع الرموز باللون الأخضر.

بعد ذلك من القائمة، اختر separation من شريط القائمة العلوي ثم wash. الآن من شريط القائمة السفلي، اختر rinse من خيار القائمة المنبثقة متبوعاً بـ run لبدء عملية التجهيز (priming). وبمجرد اكتمال عملية التجهيز بنجاح، ستظهر الأداة أنها جاهزة لعملية separation.

من قائمة الحالة، ضع الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter الذي يحتوي على الخلايا الموسومة مغناطيسياً في الصف A من حامل أنابيب مبرد وبحجم مناسب. ثم ضع أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter لجمع الجزء السالب في الصف B وأنبوباً مخروطياً سعة 15 milliliter لجمع الجزء الموجب في الصف C، واختر برنامج POS cell S cell separation للاصطفاء الموجب للخلايا المستهدفة الموسومة في الوضع الحساس من العينات. عند بدء البرنامج، سيتم الاحتفاظ بالخلايا المستهدفة الموسومة مغناطيسياً في عمود AutoMax بينما يتم تحرير الخلايا غير الموسومة في أنبوب جمع الجزء السالب في الصف B. بعد ذلك، سيتم سحب المغناطيس وتحرير الخلايا المستهدفة الموسومة في أنبوب الجمع الموجب في الصف C من حامل الأنابيب.

بعد عملية الإثراء، استخدم صبغة trian blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer) لإعادة عد الكسور الموجبة والسالبة لـ GR one. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا بتركيز يتراوح من 1×10⁷ cells per milliliter إلى 2×10⁷ cells per milliliter في وسط تلوين بتركيز 3%، وانقل 50 µL إلى أنابيب fax المسمى بدقة. قم بتلوين الخلايا باستخدام MAC one وصبغة الحيوية DPI من أجل قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) وتعويضات التلوين الأحادي.

قم بإجراء عملية الحصول على البيانات باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد النسب المئوية للخلايا الموجبة لـ GR one والخلايا السالبة لـ GR one، وكذلك لمقارنة النسب المئوية لـ MDSC قبل وبعد عملية AutoMax والتعزيز. تم استئصال الطحال من الفئران الحاملة لأورام البنكرياس والفئران السليمة، ومعالجتها لتحويلها إلى معلقات من الخلايا المفردة كما هو موضح في هذا المقال المرئي. أُجري قياس التدفق الخلوي لفحص الكريات البيضاء السليمة المصبوغة سطحياً بأجسام مضادة مقترنة بفلورسنت لـ MAC one و GR one، وكما هو موضح هنا، تظهر نسبة منخفضة جداً تبلغ 1.19% من خلايا MDCs الموجبة لـ MAC one و GR one قبل تعزيز AutoMax. ومع ذلك، بعد تعزيز المجموعة الموجبة لـ GR one، تصبح هذه المجموعة الفرعية من الخلايا أكبر بشكل ملحوظ، حيث تصل إلى 10.5% من الفئران السليمة، وهي الآن قابلة للمقارنة بنسبة 25.3% من الفئران الحاملة للأورام.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى بما في ذلك تسريع MDSC، والفرز القائم على قياس التدفق الخلوي في تجارب النقل المعتمدة في الجسم الحي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، واللطخة الغربية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالآليات الجزيئية المسؤولة عن توسع MDSC، وهجرته، وتمايزه، وتثبيطه للاستجابات المناعية.