الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف تفاعلات بروتين جديدة خارج الخلية تشارك في عمليات التعرف الخلوي ، ولا سيما بروتينات المستقبلات المضمنة في الغشاء. تم تصميم نهج AveXis للتحايل على صلات التفاعل الضعيفة للغاية التي تميز هذه الفئة من تفاعلات البروتين وحقيقة أن بروتينات الغشاء يصعب التلاعب بها كيميائيا حيويا. يتم تحقيق ذلك من خلال تجميع مكتبة بروتين مؤتلفة أولا للمناطق خارج الخلية لمستقبلات سطح الخلية.

يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم بلازميدات التعبير لإنتاج مناطق المجال الخارجي للمستقبلات كشظايا قابلة للذوبان مثل كل من الطعوم الحيوية أحادية اللون وإنزيم الخماسي الموسومة بالثناء. الخطوة الثانية هي التعبير عن البروتينات وتطبيعها لتكون جاهزة لفحص التفاعل. يتم إنتاج جميع البروتينات في خلايا الثدييات لضمان إضافة تعديلات ما بعد الترجمة مثل diss والكبريتيد والروابط والارتباط بالجليكوزيل.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في التأكد من تطبيع بروتينات الطعم والفريسة داخل المكتبة إلى مستويات العتبة. بعد ذلك يأتي الجزء المثير ، وهو فحص التفاعلات الجديدة. يتم ترتيب بيتس في آبار فردية من صفيحة ميكروت ثم يتم فحصها بحثا عن تفاعلات باستخدام الثناء.

ثم يتم تنفيذ خطوة الغسيل. الخطوة الأخيرة هي إضافة الركيزة للإنزيم لاكتشاف أي ثناء تم التقاطه على مصفوفات بروتينات الطعم. في النهاية ، يمكن أن تظهر نتائج شاشة VEX مستقبلات متصفحي الخلايا القادرة على تكوين شركاء ملزمين ، وبالتالي قد تشارك في عمليات التعرف والاتصال بين الخلايا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية لطرق استخراج البروتين الشائعة ، مثل الخميرة هجينة أو تنقية كيميائية حيوية ، هي أنها مصممة خصيصا للكشف عن تفاعلات بروتين البروتين خارج الخلية. إنه مناسب بشكل خاص لاكتشاف تفاعلات جديدة بين بروتينات المستقبلات المربوطة بالغشاء. يصعب اكتشاف هذه التفاعلات باستخدام تقنيات أخرى لأن بروتينات الغشاء يصعب التلاعب بها كيميائيا حيوية وتفاعلاتها المضادة للمستقبلات النموذجية ضعيفة للغاية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بكيفية التعرف على الخلايا والتواصل مع بعضها البعض. على المستوى الجزيئي ، يمكن استخدامه للإجابة على الأسئلة المتعلقة بالعمليات البيولوجية الأساسية مثل بروتينات المستقبلات المعروضة على سطح البويضات المنوية التي تجمع مع بعضها البعض ، أو تفاعلات ترابط المستقبلات المسؤولة عن السلوكيات الخلوية مثل اندماج الخلايا العضلية أو تكوين القمة العصبية. يتمثل التحدي الرئيسي في هذا النهج في تجميع مكتبات البروتين للطعم والصلاة التي يمكن من خلالها فحص التفاعلات.

من المهم أيضا التأكد من تطبيع بروتينات الطعم والفريسة ضمن مستويات العتبة المطلوبة للمقايس. هذا يقلل من التكرار السلبي الكاذب والتكرار الإيجابي الكاذب. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة خلال فترة الدكتوراه عندما كنت أحاول تحديد شريك ملزم لبروتين سطح الخلية CD 200.

في الأساس ، كنت أطرح السؤال ، ما هو نمط الارتباط لهذا المستقبل المعين لسطح الخلية؟ حتى اليوم؟ لا يزال هذا سؤالا صعبا من الناحية الفنية للإجابة عليه في ذلك الوقت ، ومع ذلك ، كان الجينوم البشري على وشك الاكتمال وأدركت أنه نظرا لأن لدينا الآن قائمة كاملة بجميع مستقبلات سطح الخلية في الجينوم ، يمكننا الآن بدلا من ذلك أن نسأل ضمن هذه المجموعة من بروتينات المستقبلات التي يمكن أن تتفاعل تقنيا.

هذا سؤال أسهل بكثير للإجابة عليه ، وكانت AveXis هي الطريقة التي طورناها للإجابة عليه. بمجرد إنشاء مكتبة من نواقل الطعم والتعبير المسبق ، استعد لنقلها إلى خلايا HEC 2 9 3 E تبدأ بزرع الخلايا في اليوم السابق للتعداء بكثافة 250،000 خلية لكل مليلتر في 50 مل من وسائط حرة 2 9 3 لضمان ابتهاج البيوتين بكفاءة. استكمل الوسيط المستخدم لإنتاج بروتينات الطعم ، وليس بروتينات الفريسة ب d biotin مع جميع الألواح المحضرة ، واحتضان الخلايا طوال الليل في الظروف القياسية.

نظرا لأن البيوتين ذوبان منخفض ومحلول دقيق ، فإننا نفضل وزن البيوتين الإضافي ثم إضافته إلى الوسائط ورجها بقوة في اليوم التالي. قم بنقل 50 مل من الخلايا المستزرعة مع 25 ميكروغراما من الطعم أو بلازميد الفريسة باستخدام كاشف تعداء مناسب لإنتاج الطعوم الحيوية المصنوعة من البترول السريع. يتكون الطعم بنسبة 10 إلى واحد مع بلازميدات تشفر شكلا مفرزا من بروتين ELI البيوتين ليغاز لكل حصاد.

بعد خمسة أيام من التعدي ، يتم التصويب بالثقافات عن طريق شحوب الخلايا أولا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 مرة من الجاذبية لمدة 20 دقيقة وثانيا تصفية المادة الطافية S من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تتمثل إحدى السمات الرئيسية ل AveXis في إفراز البروتينات المؤتلفة ، ويمكن تخفيفها أو تركيزها ضمن أنشطة العتبة. وجدنا أن البروتينات المؤتلفة لها تعبير متغير يصل إلى أربعة أوامر من حيث الحجم ، وبالتالي فإن خطوة التطبيع تقلل من حدوث الإيجابيات الكاذبة أثناء خطوات الفحص.

لبدء تطبيع الطعم ، يجب إزالة البيوتين غير المترافق من الوسائط عن طريق غسيل الكلى لأنه سيتنافس على بروتين الطعم البيوتينيل للارتباط بالستريبت في مواقع الربط بدءا من تأمين الطعم في أنبوب غسيل الكلى. لضمان غسيل الكلى الفعال للبروتينات المؤتلفة ، وجدنا أنه من المهم توفير مساحة سطح زائدة لأنبوب غسيل الكلى. عادة ، نقدم أنابيب أكثر بمرتين إلى ثلاث مرات مما هو مطلوب فعليا للحجم الذي يتم تحليله.

على مدى 24 ساعة ، تم غسيل الكلى للطعم على نطاق واسع ضد مخزن مؤقت مناسب مثل PBS بعد إجراء غسيل الكلى. تبدأ ELIZA بسد آبار صفيحة ميكروت مشفرة بالبكتيريا العقدية مع PBST التي تحتوي على BSA لمدة 15 دقيقة. في هذه الأثناء ، على طبق نظيف ، قم بعمل سلسلة من أربعة من واحد إلى ثلاثة مخففات من بروتينات الطعم في PBST مع 2٪ BSA.

بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة ، انقل التخفيف إلى اللوحة المشفرة TTR العقدية واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة من درجة حرارة الغرفة بعد ساعة ، واغسل الآبار ثم إلى كل منها ، أضف جيدا 100 ميكرولتر من ميكروغرامين لكل مليلتر OX 68. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أخرى. بعد الحضانة الثانية ، قم بعمل سلسلة غسيل أخرى وقم بتحميل اللوحة بالفوسفاتيز القلوي المضاد للولايات المتحدة.

احتضان الطبق لمدة ساعة ثالثة من درجة حرارة الغرفة. الآن اغسل الطبق ثلاث مرات في PBST وامنحه غسلا نهائيا PBS. لإزالة أي منظف متبقي ، أضف 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الركيزة 1 0 4 في المخزن المؤقت لأمين الإيثانول بعد ساعة.

في درجة حرارة الغرفة قياس الامتصاص 4 0 5 نانومتر ، تم الكشف عن سلسلة تخفيف من أربعة أنواع مختلفة من الطعم الممحلول بواسطة إليزا باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للقرص المضغوط رباعي العلامات. إذا كانت بروتينات الطعم السريع غير المخففة غير كافية لتشبع جميع مواقع ربط البيوتين لصفيحة مطلية ب ENC العقدية ، فقم بتركيز البروتين باستخدام مكثف الدوران Viva. خلاف ذلك ، استخدم بروتين الطعم بتركيز مخفف في PBST مع 2٪ BSA.

هذا يكفي فقط لتشبع موقع ربط البيوتين للمقايسة. حدد المستويات النسبية التي يتم عندها التعبير عن البروتينات المسبقة باستخدام نشاط إنزيم بيتا لاكتاماز. ابدأ بعمل سلسلة تخفيف من supinate تحتوي على البروتينات في PBST 2٪ BSA المخزن المؤقت.

ثم أضف 20 ميكرولترا من التخفيف إلى 60 ميكرولترا من محلول السبيت النيتروز المحمل في طبق. انقل اللوحة على الفور إلى قارئ اللوحة وقم بقياس امتصاص 4 85 نانومتر مرة كل دقيقة لمدة 20 دقيقة التالية باستخدام مكثفات الطرد المركزي أو PBST المخفف مع 2٪ BSA. اضبط التركيز النهائي للعينات لتحلل كل النيتروجين في الفحص في حوالي سبع دقائق ، أي حوالي اثنين من دوران النيتروجين في الدقيقة.

ابدأ شاشة AveXis عن طريق غسل صفيحة مطلية ب STREP TAVR ENC في PBST والنقر على اللوحة الجافة على منشفة ورقية. بعد ذلك ، أضف PBST مع BSA إلى كل بئر واحتضن الطبق لمدة 30 دقيقة. هذا يمنع مواقع ربط البروتين الزائفة.

داخل كل منها ، قم بإزالة محلول الحظر بنقرة ذكية من اللوحة فوق الحوض وأضف 100 ميكرولتر من الطعم الأحادي البيوتيني الطبيعي إلى الآبار المناسبة. احتضن الطبق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة عينات الطعم من اللوحة بنقرة أخرى واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBST.

ثم اضغط على التجفيف بعد الغسيل الثالث. أضف الآن 100 ميكرولتر من بناء فريسة الخماسية الطبيعية إلى كل بئر واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، امنح الطبق ثلاث غسلات أخرى باستخدام PBST وغسلها أخيرا باستخدام PBS فقط.

أخيرا ، أضف 60 ميكرولترا من محلول النيتروز السبعة إلى كل بئر واحتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، أو يفضل احتضان الألواح لمدة 16 ساعة عند أربع درجات SIUs. في اليوم التالي ، ستتحول التفاعلات الإيجابية إلى اللون الأحمر. التقط صورة فوتوغرافية للوحة للحصول على سجل مرئي ثم حدد كمية التفاعلات عند امتصاص 4 85 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

بعد حوالي 10 دقائق من بداية تفاعل فحص AveXis ، شوهدت تغيرات في اللون الأصفر إلى الأحمر في كل من التحكم في التقاط الفريسة بوساطة الجسم المضاد وأيضا تفاعل التحكم الإيجابي. يشير هذا التغير في اللون إلى التحلل المائي للنيتروز في الركيزة. يمكن ملاحظة بعض التفاعلات الإيجابية في هذا المقياس الزمني ، لكن معظمها استغرق بضع ساعات للظهور.

عادة ، لوحظ معدل إصابة يتراوح بين 0.4 و 0.6٪ إيجابيات. بمجرد تحضير مكتبات البروتين ، يمكن إجراء جزء الفحص من هذه التقنية بسرعة. من الممكن تماما فحص ما يصل إلى 12 لوحة في يوم واحد بعد تحديد التفاعل.

التالية الأكثر أهمية هي أولا إظهار أنه يمكن تكرار التفاعل باستخدام مستحضرات البروتين المستقلة الطازجة. ثانيا ، نحدد دائما ما إذا كان التفاعل مستقلا عن اتجاه فريسة الطعم ، أي هل يمكن الرد بالمثل؟ يتضمن ذلك استنساخ مجالات متجه الطعم في متجه الفريسة والعكس صحيح.

التفاعلات التي يمكن تكرارها ومتبادلها ثقة عالية وقد ثبت دائما أنها إيجابية. باستخدام تقنيات أخرى مثل رنين البلازما السطحية ، نود استخدام البلازما السطحية في الرنين للتحقق من صحة أي تفاعلات نعيد تحديدها. الأهم من ذلك ، أن هذا يوفر دليلا على أن المكونين المنقيين يمكن أن يتفاعلا بشكل مباشر ويمكن استخدامه أيضا لإظهار أن الربط ثابت وبالتالي محدد.