شفط Micropipette من خلايا الركيزة المرفقة لتقدير تصلب الخليوي

يهدف التجربة التالية إلى تحليل الخصائص اللزوجة المرنة الخلوية تحت ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تسليط ضغط سلبي على غشاء الخلية عبر ماصة مجهرية متصلة بمحول ضغط تم تصنيعه من الشعيرات الزجاجية باستخدام ساحب الماصات المجهرية. يتم تركيب الماصة على مناور مجهري دقيق مثبت على منصة مجهر مقلوب، ثم يتم تقريب طرف الماصة من الخلية.

بعد ذلك، يتم إنشاء سدادة بين طرف الماصة والغشاء الخلوي، ثم يتم قياس تشوه الغشاء داخل الماصة استجابةً لخطوة مطبقة من الضغط السلبي. وتُستخلص نتائج تظهر تأثيرات المعالجات المختلفة على الخصائص الميكانيكية الحيوية الخلوية بناءً على درجة تشوه الغشاء استجابةً لقوة محددة بدقة. يهدف مختبرنا إلى استقصاء تأثير عسر شحميات الدم على الخصائص الفيزيائية الحيوية والميكانيكية الحيوية للخلايا البطانية الوعائية، وسنطلعكم اليوم على طريقة تسمى شفط الماصات الدقيقة (micropipet aspiration) والتي نستخدمها لقياس صلابة الخلايا.

تمتد آثار هذه التقنية نحو الفهم الأساسي للميكانيكا الحيوية الخلوية في آليات متعددة مثل تكوين الأوعية الدموية، والاستشعار الميكانيكي، والهجرة، وغيرها. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الميكانيكا الحيوية الخلوية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الأغشية النموذجية، أو العضيات داخل الخلوية، أو الأنسجة. ولتحديد الغشاء الخلوي بصرياً ومراقبة بروز الغشاء داخل الماصة، يتم صبغ أغشية الخلايا البطانية الوعائية بصبغة فلورية محبة للدهون.

للبدء، قم بتخفيف الصبغة المركزة إلى تركيز عمل باستخدام محلول PBS دافئ، ثم عرض الخليط للموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق لتفكيك تجمعات D. بعد عملية تدوير لمدة خمس دقائق في جهاز الطرد المركزي الدقيق، قم بإزالة الراشح، ثم اغسل الخلايا البطانية الوعائية بإضافة 0.5 ملليلتر من PBS. بعد خمس دقائق، قم بشفط المحلول وكرر عملية الغسل مرتين إضافيتين.

ثم أضف محلول dice إلى الخلايا وتحضن لمدة 30 دقيقة في حضانة عند 37 degrees Celsius. بعد التحضين، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS كما سبق. يتم سحب الماصات الدقيقة عن طريق تسخين شعيرية زجاجية من المنتصف.

عندما يبدأ الزجاج في الانصهار، يتم سحب نصفي الشعيرية بعيداً عن بعضهما لتكوين ماصتين مجهريتين. وتتراوح أطراف الماصات المستخدمة في هذه التجارب عادةً بين 2 و6 ميكرون من القطر الخارجي، وبناءً على حجم الخلية، يجب أن يقترب شكل الطرف من الأنبوب الأسطواني لبدء إدخال الشعيرية الزجاجية في جهاز سحب الماصات.

في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام جهاز سحب الماصات الأفقي Suter P 97 باستخدام برنامج مُحسَّن. يوفر هذا الجهاز خيارات برمجية متعددة لتغيير السرعة ومعاملات السحب الأخرى. انتقل الآن لتفعيل برنامج السحب.

بعد سحب كل ماصة دقيقة، تحقق من شكل الطرف تحت المجهر. بعد صقل الطرف بالحرارة، املأ الماصة الدقيقة بمحلول ملحي فسيولوجي مثل PBS أو أوساط نمو غير فلورية. من المهم أن يكون المحلول مضافاً إليه 30% serum للسماح لغشاء الخلية بالانتقال بسلاسة إلى داخل الماصة. في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بإمكانيات إلغاء الالتفاف ثلاثي الأبعاد (3D deconvolution) مع كاميرا فيديو متصلة بجهاز كمبيوتر، ومحول ضغط، ومحطة خالية من الاهتزازات، وجهاز تحريك دقيق للبدء في تثبيت الخلايا داخل غرفة شفط دقيقة عن طريق رفع الخلايا من ركائزها ونقلها بالماصة إلى غرفة طولية ضحلة مثبتة على المجهر الفلوري المقلوب.

يكمن الهدف من استخدام غرفة طولية ضحلة في السماح للماصة الدقيقة بالاقتراب من الخلايا بزاوية ضحلة جداً وبأقرب شكل ممكن من الوضع الأفقي. يتم ذلك لتمكين رؤية الغشاء المسحوب إلى داخل الماصة الدقيقة في مستوى بؤري واحد. ضع الماصة الدقيقة المملوءة في حامل الماصات المتصل بمحول طاقة عبر أنبوب مرن، مع ضبط القطر ليتناسب مع موصل حامل الماصات من أجل إحكام الربط.

في بداية كل تجربة، يتم موازنة الضغط داخل الماصة ليتساوى مع الضغط الجوي، ثم ثبّت الماصة على جهاز تحريك دقيق (micro manipulator) يسمح بالتحكم الدقيق في حركات الماصة ضمن نطاق الميكرون. ضع الماصة بزاوية مائلة قليلاً بالنسبة لقاع الغرفة وقرّب طرف الماصة من مركز المجال البصري. يجب أن يكون ساق الماصة، وهو الجزء الأسطواني من طرف الماصة الذي يتم فيه سحب الغشاء، محاذياً أفقياً لمستوى البؤرة.

لتحقيق هذا الموضع الأول، ضع الماصة بأقل زاوية ممكنة ثم اثنِ ساق الماصة مقابل قاع الغرفة. ونظراً لأن الساق رقيقة جداً، فهي مرنة بما يكفي لتنزلق على قاع الغرفة أثناء الاقتراب من الخلية. أنزل الماصة الدقيقة ببطء إلى جانب خلية واحدة باستخدام وحدة التحكم الخشنة حتى تقترب من مستوى تركيز الخلية.

بعد ذلك، وباستخدام الملقط الدقيق، حرك الماصة الدقيقة نحو حافة الخلية حتى يلامس طرف الماصة الغشاء بلطف. التقط صورة واحدة لمراقبة موضع الماصة. يتم تكوين سدادات جيدة عندما يكون طرف الماصة بالكامل في تلامس تام مع سطح الخلية ويكون هذا التلامس مستقراً.

بعد ذلك، يتم تطبيق خطوة من الضغط السلبي باستخدام المحول والحفاظ عليها حتى يستقر بروز الغشاء. تختلف كمية الضغط اللازمة لسحب الغشاء إلى داخل الماصة اعتماداً على نوع الخلية والظروف التجريبية المحددة. وعادة ما يُلاحظ التشوه الأولي عند تطبيق ضغط في نطاق يتراوح من -2 إلى -15 mmHg.

عند تسليط الضغط، يتشوه الغشاء تدريجياً نحو الماصة حتى يستقر عند طول معين. وتستغرق هذه العملية عادةً من دقيقتين إلى ثلاث دقائق، وخلال هذا الوقت، يلزم التقاط صور لتشوه الغشاء كل 30 ثانية لتتبع تقدم الغشاء المسحوب إلى داخل الماصة. وأخيراً، يتم زيادة الضغط إلى المستوى التالي بخطوات تتراوح بين 2 إلى 5 millimeters of mercury.

كرر الإجراء بأكمله حتى ينفصل بروز الغشاء عن الخلية وينتقل إلى داخل الماصة، وعند هذه النقطة يتم إيقاف التجربة. ولتقدير درجة تشوه الغشاء كمياً، يتم قياس الطول الممتص من طرف الماصة إلى رأس محيط بروز الغشاء. وستطبق الماصة الأكبر قوة أكبر على غشاء الخلية عند نفس مستوى الضغط لمراعاة التباين بين أقطار الماصات.

يتم تطبيع طول السحب بناءً على قطر الماصة المقاس لكل تجربة للتحقق من صحة استخدام تقنية السحب الدقيق للخلايا الملتصقة بالركيزة؛ وقد تم اختبار ذلك من خلال تعطيل F actin، مما أدى إلى انخفاض في صلابة الخلايا البطانية للشريان الأبهر البقري وفقاً للتقدير بهذه الطريقة. وتظهر هنا سلسلة نموذجية من الصور الفلورية لغشاء بطاني يخضع لتشوه تدريجي استجابةً للضغط السلبي المطبق عبر الماصة الدقيقة كما هو متوقع. يتم سحب الغشاء تدريجياً إلى داخل الماصة، ويزداد طول السحب كدالة للضغط المطبق، وتوضح المسارات الزمنية للتشوه أن تعطيل f actin يزيد بشكل ملحوظ من أطوال السحب للبروزات تحت جميع ظروف الضغط.

باستخدام هذا النهج، تبيّن أن صلابة الخلية تزداد عند استنفاد الكوليسترول من الأغشية الخلوية، في حين لم يكن لإثراء الكوليسترول أي تأثير. هنا، تظهر خلية غنية بالكوليسترول، وخلية ضابطة، وخلية مستنفدة الكوليسترول بعد الوصول إلى أقصى أطوال شفط عند ضغط -15 millimeters of mercury. بدأت النتوءات عادةً في التطور عند -10 millimeters of mercury، وكان من الممكن قياس الفترات الزمنية لتشوه الغشاء عند الضغوط السالبة البالغة 10 و15 و20 millimeters of mercury.

هنا، تم رسم أطوال الشفط القصوى كدالة في الضغط المطبق. وكان الطول المعياري الأقصى في الخلايا المستنفدة أقل بشكل ملحوظ من الخلايا الضابطة عند ضغوط تبلغ -15 millimeters of mercury و-20 millimeters of mercury. أدى تطبيق ضغوط سلبية تزيد عن 25 millimeters of mercury إلى انفصال البروز المشفوط مكونًا قطعة منفصلة.

كان مستوى الضغط الذي أدى إلى انفصال الغشاء متماثلاً تحت ظروف الكوليسترول المختلفة، وكانت هذه ملاحظة غير متوقعة، حيث أظهرت الدراسات السابقة أن زيادة كوليسترول الغشاء تعزز صلابة الطبقات الثنائية للدهون الغشائية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذه التقنية، من المهم تذكر أن هذه التجربة تُجرى على خلايا فردية.

وبناءً على ذلك، ينبغي تحليل ثلاث إلى خمس خلايا لكل حالة، في كل تجربة، وذلك لإجمالي ثلاث تجارب.