الطيفية Karyotyping إلى دراسة حالة شذوذ الكروموسومات في البشر والفئران مع مرض الكلى المتعدد الكيسات

الهدف من هذا الإجراء هو وسم الكروموسومات باستخدام مجسات صبغية لتحديد الزيغ الكروموسومي وعيوب الانفصال لدى الفئران والبشر المصابين بمرض الكلى متعدد الكيسات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد الخلايا من البشر أو الفئران ومعالجتها باستخدام smid، يليه تثبيت وتحضير انتشارات الطور الاستوائي على شرائح زجاجية. بعد ذلك، يتم إجراء معالجة مسبقة للشريحة لإزالة الحمض النووي الريبي (RNA) والسيتوبلازم الزائد اللذين قد يتداخلان مع عملية التهجين.

يتم ذلك عن طريق الهضم باستخدام RNAs والبيبسين على التوالي. ثم يتم إجراء عملية مسخ للكروموسومات والمسبار، يتبعها التهجين لوسم الكروموسومات. وتتمثل الخطوة النهائية في الكشف عن المسبار باستخدام صبغات فلورية.

وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التشوهات العددية والتركيبية في الكروموسومات من خلال الفلورة، والمجهر، والتقاط الصور وتحليلها بواسطة برنامج Skyview. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقنيات ثني GIMs الكلاسيكية، في أنها توفر معلومات إضافية حول الانحرافات الكروموسومية المعقدة، مثل الانتقالات الكروموسومية وإعادة الترتيب الكروموسومي المعقد الذي لا يمكن توصيفه بتقنيات الثني الكلاسيكية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال مرض الكلى متعدد الكيسات، مثل آلية تكوين الكلى الكيسية.

ستقوم الدكتورة وئام أبو باستعراض الإجراء، بمساعدة باحث ما بعد الدكتوراه المتميز من مختبرنا. ابدأ بزراعة الخلايا البطانية في وسط DMEM يحتوي على 10 إلى 15% من مصل العجل الجنيني و1% من البنسلين والستربتومايسين عند درجة حرارة 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاحم تتراوح بين 70 إلى 80%. بعد ذلك، تُعالج الخلايا بمحلول Cole بتركيز نهائي قدره 0.05 mg/mL لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C قبل عملية الحصاد. ولحصاد الخلايا، ابدأ بجمع الوسط الذي يحتوي على أي خلايا عائمة في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 mL.

اشطف الخلايا الموجودة في الطبق باستخدام PBS معقم لمرة واحدة بعد تحضينها مع trips معقم لمدة دقيقة إلى دقيقتين، ثم احصد واجمع الخلايا المتبقية في نفس الأنبوب. بعد تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق، اسحب معظم السائل من الأنبوب مع ترك حوالي 0.5 milliliters فوق الرواسب. قم بتفكيك كتلة الخلايا المترسبة عن طريق نقر الأنبوب.

بعد ذلك، وبناءً على حجم الراسب، أضف من 5 إلى 10 milliliters من محلول عالي التوتر يتكون من 0.56% من كلوريد البوتاسيوم في ماء مقطر، ثم قم بحضن المعلق عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين 30 إلى 45 دقيقة. وعقب عملية الحضن، استخدم ماصة صغيرة سعة 1 milliliter لإضافة قطرة واحدة من محلول تثبيت مبرد بالثلج لكل 1 milliliter من معلق الخلايا عالي التوتر. ثم اقلب الأنبوب برفق للمزج بعد طرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1,200 دورة في الدقيقة.

قم بسحب السائل الطافي كما سبق. بعد ذلك، أضف ببطء 1 mL من محلول التثبيت الطازج مع تحريك الراسب برفق. ثم أضف بلطف 4 mL أخرى من محلول التثبيت على جدار الأنبوب.

يُعد هذا الإجراء بالغ الأهمية لضمان عدم انحباس انتشارات الطور الاستوائي داخل تكتلات الخلايا. بعد تكرار خطوة الطرد المركزي وسحب السائل الطافي، استبدل الـ 5 إلى 10 ملليلتر من المثبت عن طريق سحب المثبت ببطء على جدران الأنبوب باستخدام الماصة. في هذه المرحلة، يمكن تخزين الخلايا في أنبوب محكم الإغلاق عند درجة حرارة -20 °C للتخزين قصير المدى أو -80 °C للتخزين طويل المدى حتى يحين وقت المتابعة.

عندما تصبح جاهزاً للمتابعة، تحقق من عدد كروموسومات الطور الاستوائي في تحضير الخلايا. نظف الشريحة باستخدام الإيثانول المطلق. بعد ذلك، اغمس الشريحة في الماء المقطر حوالي 10 مرات لتكوين غلاف مائي على سطح الشريحة، ثم ضع الشريحة على لوح زجاجي وأسقط من 15 إلى 20 µL من معلق الخلايا من ارتفاع 10 بوصات فوق الشريحة.

ضع الشريحة في حمام مائي مضبوط على درجة حرارة 65 إلى 70 درجة Celsius لمدة تتراوح بين دقيقة ودقيقتين، ثم اتركها لتجف. افحص الشريحة تحت مجهر ضوئي باستخدام العدسات الشيئية الجافة بقوة تكبير 10 مرات و40 مرة. تأكد من وجود كروموسومات في الطور الاستوائي وأن الانتشارات متباعدة بشكل متساوٍ. افحص السيتوبلازم المحيط بالكروموسومات.

إذا كان السيتوبلازم موجوداً كما يظهر هنا، فاستمر في المعالجة المسبقة للشريحة. أما إذا لم يكن السيتوبلازم موجوداً وكانت الكروموسومات ذات مورفولوجيا جيدة، فلا داعي للمعالجة المسبقة للشريحة بوضع 120 µL من محلول RNA بتركيز 20 mg/mL المحضر حديثاً بنسبة تخفيف من 1 إلى 200 والمذاب في 2× SSC على غطاء زجاجي بمقاس 24 mm × 60 mm.

اقلب شريحة الطور الاستوائي بحيث يكون الوجه لأسفل على غطاء الشريحة. ثم اقلب شريحة الطور الاستوائي برفق ليكون الوجه لأعلى. ضع الشريحة داخل غرفة رطبة واتركها في الحاضنة عند 37 degrees Celsius لمدة 45 minutes.

بمجرد انقضاء وقت التحضين، قم بإزالة غطاء الزجاج بعناية دون خدش الشريحة، واغسلها بمحلول SSC المنظم مرتين في وعاء ربط، ثم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة مع الرج. في هذه الأثناء، أضف من 5 إلى 15 µL من pepin بتركيز 100 mg/mL في ماء مقطر إلى دورق نظيف، ثم أضف 100 mL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.01 M المسخن مسبقاً إلى 37 °C. من المهم إضافة PEPs إلى الدورق النظيف أولاً، وإلا فلن تذوب.

انقل هذا المحلول إلى وعاء coplan. قم بحضن شريحة الغسيل في وعاء الربط عند 37 درجة مئوية لمدة لا تتجاوز ثلاث إلى خمس دقائق بعد عملية الهضم. اغسل الشريحة مرتين في وعاء copin يحتوي على 1XPBS لمدة خمس دقائق في كل مرة مع الرج.

اتبع ذلك بعملية غسل لمدة خمس دقائق في وعاء كوبين يحتوي على PBS مضاف إليه كلوريد المغنيسيوم. ثم يتم التحضين لمدة 10 دقائق في وعاء كوبين يحتوي على 1% formaldehyde، يليه غسل نهائي في وعاء كوبين يحتوي على 1X PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم تجفيف الشرائح في أوعية كوبين تحتوي على سلسلة من الإيثانول بتركيزات 70% و80% و100% لمدة دقيقتين لكل تركيز، ثم تُترك لتجف في الهواء.

افحص الشريحة تحت مجهر ضوئي باستخدام عدسة جافة بقوة تكبير 40 مرة للتأكد من هضم العينات بشكل صحيح، وعدم وجود سيتوبلازم، والحفاظ على مورفولوجيا الكروموسومات. وأخيراً، حدد منطقة التهجين باستخدام قلم ماسي. بعد تحضير محلول نزع الطبيعة حديثاً، وضعه في وعاء كوبن وقم بتسخينه مسبقاً إلى 70 °C في حمام مائي.

بعد ذلك، ضع الشريحة في وعاء كوشين (cochin jar) يحتوي على محلول نزع الطبيعة المسخن مسبقاً في حمام مائي عند 70 °C لمدة تتراوح من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. وعقب فترة الحضن، ضع الشريحة فوراً في إيثانول بتركيز 70% مبرد بالثلج لمدة ثلاث دقائق، ثم في إيثانول بتركيز 80% و100% لمدة ثلاث دقائق لكل منهما، وبعد ذلك اتركها لتجف في الهواء. افحص الشريحة لتقييم مورفولوجيا الكروموسومات، وظهور كروموسومات داكنة لا تبدو باهتة أو لامعة.

يشير إلى جودة الكروموسومات أو المورفولوجيا. قم بتدفئة صبغة sky paint. قم بعملية التحضين عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بالرج بمزيج دوامي (vortex) والطرد المركزي لفترة وجيزة بسرعة 1000 دورة لمدة دقائق. قم بمسخ المسبار في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) عند درجة حرارة 85 °C لمدة خمس دقائق، يليه التحضين عند درجة حرارة 37 °C. لمدة ساعة واحدة، ضع 10 µL من المسبار الممسوخ على منطقة التهجين وقم بتغطيتها بشريحة غطاء زجاجية مقاس 22 mm × 40 mm.

مع التأكد من عدم حبس فقاعات هوائية، قم بختم حواف غطاء الشريحة باستخدام المطاط السائل، ثم حضنها في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 48 إلى 72 ساعة. ارفع غطاء الشريحة بعناية وضع الشريحة في وعاء اقتران يحتوي على محلول غسيل مُحضّر حديثاً، وبشرط أن يكون قد تم تسخينه مسبقاً إلى 45 درجة مئوية. اغسل الشريحة لمدة خمس دقائق، ثلاث مرات عند 45 درجة مئوية في حمام مائي هزاز بسرعة 45 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك، تُغسل الشرائح مرتين في محلول الغسيل الثاني عند 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في كل مرة مع الرج، يليه خمس دقائق في محلول الغسيل الثالث عند 45 درجة مئوية مع الرج. بعد ذلك، يُوضع 80 µL من كاشف الحجب. ثم تُوضع شريحة غطاء زجاجية وتُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بإزالة غطاء الشريحة واترك السائل يتصرف. أضف 80 µL من كاشف صبغ sci-fi. ضع غطاء الشريحة ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 40 دقيقة. بعد التحضين، اغسل الشريحة باستخدام محلول الغسيل three عند 45 °C لمدة خمس دقائق، وتكرر العملية ثلاث مرات مع الرج.

بعد ذلك، ضع 80 µL من كاشف تلوين PS 5.5. ضع غطاء الشريحة وحضنها عند 37 °C لمدة 40 دقيقة، وبعد فترة التحضين، اغسلها ثلاث مرات بمحلول الغسيل ثلاثة كما سبق. أخيراً، أمل الشريحة واسمح للسائل بالتصريف.

ضع 20 µL من كاشف Antifa dappy وضع شريحة غطاء مجهرية مقاس 24 mm × 60 mm. قم بإزالة فقاعات الهواء التي قد تكون تكونت بعناية؛ ويمكن تصوير الشرائح فوراً أو تخزينها عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. تم التقاط هذه الصورة المجهرية لانتشار طور استوائي طبيعي من فأر من النوع البري باستخدام مجهر Olympus مجهز بعدسة غمر زيتية بقوة 60×.

مرشح تمرير نطاق ثلاثي مصمم خصيصاً يُعرف باسم المكعب الطيفي (spectral cube)، ومرشح dappy، ووحدة مقياس تداخل sac مع كاميرا CCD. أُجريت النمطيات النووية الطيفية باستخدام برنامج skyview. تُظهر اللوحة العلوية اليسرى انتشار الطور الاستوائي المسمى، وتُظهر اللوحة العلوية اليمنى صورة للمجال المضيء للانتشار.

تظهر اللوحة السفلية الكروموسومات مرتبة تصاعدياً باستخدام برنامج skyview. تُظهر صورة sky هذه لانتشار طور استوائي من فأر pkd one homozygous knockout عدداً غير طبيعي من الكروموسومات، حيث يوجد 68 كروموسوماً بدلاً من 40. كما تظهر أيضاً تشوهات كروموسومية مثل حذف الكروموسوم الثامن، أو انتقالات كروموسومية، مثل تلك التي حدثت بين الكروموسومات 5 و16، وأيضاً بين الكروموسومات 11 و19.

تحتوي صورة SKY هذه لانتشار الطور الاستوائي للكروموسومات البشرية المأخوذة من النسيج الوعائي لمريض غير مصاب بـ A-D-P-K-D على النمط النووي الطبيعي للأنثى والمكون من 44 كروموسومًا جسديًا وكروموسومين XXX. وتظهر صورة SKY النهائية هذه انتشار الطور الاستوائي من النسيج الوعائي لمريض مصاب بـ A-D-P-K-D بنمط نووي غير طبيعي مكون من 88 كروموسومًا جسديًا وأربعة كروموسومات جنسية XXXX. نسخة رئيسية واحدة.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.