تقنية الفحص المجهري للTIRF التصوير، في الوقت الحقيقي في وقت واحد من TCR وما يرتبط بها من البروتينات اشارة

يصف هذا الفيديو إجراء لتتبع أحداث إشارات مستقبلات الخلايا التائية باستخدام اكتساب متزامن ثنائي القناة. يتم نقل الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي أو المجهر العشبي لأول خلية تائية باستخدام بلازميد يشفر GFP الموسوم ب ZAP 70 ، وهي طبقة ثنائية دهنية مدعومة بالزجاج ، والتي تشتمل على الببتيد المثبت بالدهون. يتم تحضير مجمعات معقد التوافق النسيجي الكبير وجزيئات الالتصاق والجزيئات التحفيز المشترك.

إضافة الخلايا التائية المنقولة ZAP 70 إلى الطبقة الثنائية عندما يتم تعشيق مستقبلات الخلايا التائية بواسطة مجمعات معقد التوافق النسيجي الكبير الببتيد. يتم فسفرة ثلاث سلاسل مرتبطة بمستقبلات الخلايا التائية بواسطة عائلة SARC kinase LCK ، ويتم تجنيد kinase zap 70 من السيتوبلازم. ثم يتم تصنيف مستقبلات الخلية التائية بالفلورسنت ويتم إجراء التصوير حيث يتم غمر الخلايا في وسط بمعامل انكسار أقل من زجاج الغطاء وتضيء بواسطة شعاع ليزر بزاوية تخضع لانعكاس داخلي كامل.

يولد هذا موجة زائلة في واجهة الماء الزجاجية ، والتي تتحلل بشكل كبير في الوسط ، مما يسمح بعمق اختراق يتراوح من 100 إلى 200 نانومتر. وبالتالي ، فإن الفلورو الأربعة فقط في غشاء البلازما أو القريبة منه متحمسة. يكشف تحليل الصور الناتجة عن حدوث إشارات في مجموعات صغيرة لمستقبلات الخلايا التائية.

تتمثل الميزة الرئيسية للفحص المجهري العشبي أو الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي في حصولك على دقة أفضل بحيث يمكن تصور مجموعات الإشارات أو مجمعات الإشارات مثل مجموعات TCR الصغيرة بسهولة. ترافيس كريتس وتشين. سيوضح كل من باحثي ما بعد الدكتوراه في مختبري كيفية نقل الخلايا التائية الأولية للفأر باستخدام تقنية المودة النواة القصوى الماكسي ثم تصويرها باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي أو العشب M المحفز بزجاج من طبقة الصفراء الدهنية للطيور التي تحتوي على مستضد.

تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة الإشارات في الخلايا المناعية المختلفة بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا البائية والقاتل الطبيعي والخلايا الرئيسية. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لدراسة معظم أنظمة المستقبلات في خلايا الثدييات ، خاصة إذا حدثت الإشارات في مجموعات. قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في البداية حيث يصعب جدا نقل الخلايا التائية.

بالإضافة إلى ذلك ، يلزم تنسيق دقيق بحيث تكون قابلية الخلايا التائية للحياة وكفاءة التعدي ، وجودة البيلار وكذلك محاذاة المجهر تصل إلى العلامة. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في نقل الخلايا التائية الأولية الساذجة أو المنشطة في المختبر مع بلازميدات التعبير وجزيئات إشارات الترميز الموسومة بواسطة GFP باستخدام مجموعة مستجيب نواة الخلايا التائية للفأر AM maxa. عبرت جميع الخلايا التائية المستخدمة في هذه الدراسة عن A-N-D-T-C-R الذي يتعرف على ببتيد MCC الموجود في جزيء معقد التوافق النسيجي الكبير IE من K. يتم تنفيذ إجراء التعداء الموضح هنا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

ومع ذلك ، يتم تقديم بعض النصائح التي تعزز صلاحية الخلايا التائية بعد التعداد. تكون كل من قابلية البقاء وكفاءة التعدي أعلى في الخلايا التائية المنشطة في المختبر من الخلايا الساذجة ، وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول الخلايا التائية المنشطة في المختبر قبل البدء. قم بإعداد ملليلترين من وسط الخلايا التائية المكمل لكل تعداء عن طريق الجمع بين 1.9 مل من الوسط المقدم في المجموعة مكون 20 ميكرولتر ، ومكون 20 ميكرولتر B ، و 100 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية في أنبوب ملليلتر.

انقل ملليلترين من المتوسط إلى كل بئر من طبق 12 بئر. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل للسماح للوسط بموازنة موت الخلية سينتج عن تعليق Resus للخلايا المنقولة في وسط بارد أو ليس عند درجة حموضة 7.2. لتحضير خليط التعدي ، امزج 82 ميكرولترا من محلول مستجيب نواة الخلايا التائية للفأر مع 18 ميكرولترا من المكمل الثاني وخمسة ميكروغرامات من الحمض النووي البلازميد الخالي من السموم الداخلية بتركيز لا يقل عن 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر ممزوج جيدا عن طريق النقر.

انقل من خمس إلى 10 ملايين خلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 75 ضعفا في G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الدوران. استخدم شفاطة فراغ لإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية لإعادة تعليق حبيبات الخلية في خليط التعدي برفق وببطء شفط حبيبات الخلية ثلاث إلى أربع مرات حتى لا تكون هناك كتل كبيرة من الخلايا المتبقية. باستخدام ماصة ، نقل التعليق بعناية إلى amaxa vete معتمد ، مما يضمن عدم وجود فقاعات.

ضع غطاء لبرنامج المستجيب النووي qve select X 0 0 1 على جهاز المستجيب النووي. أدخل vete في حامل Q vete واضغط على الزر لتطبيق البرنامج المحدد. ثم انقل على الفور وسيط الثقافة المتوازن والمسبق إلى غطاء المحرك.

باستخدام الماصة البلاستيكية المرفقة، أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من الوسط المتوازن مسبقا إلى الماصة. ثم أضف تعليق الخلية إلى الوسط الموجود في اللوحة. قطرة قطرة.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح بالتعبير المنخفض المستوى عن البروتينات الموسومة ب GFP ولتقليل ظهور القطع الأثرية من الإفراط في التعبير. في هذا القسم ، يتم وصف طريقة لمحاذاة المجهر للتصوير المتزامن بقناتين قبل بدء تشغيل جميع مكونات المجهر. ابدأ تشغيل الكمبيوتر والبرامج.

ثم تأكد من التعرف على جميع مكونات الأجهزة بواسطة البرنامج. نظرا لأن البرنامج يبدأ بدون أي رسائل خطأ ، فقد تم اكتشاف جميع المكونات. تمييع ميكرولتر واحد من الدقة الفرعية.

يتحول فلوريس إلى مليلترين من PBS لاستخدامه كمعيار تحديد الموقع. ثم أضف 0.25 مل من تعليق الكرة المجهرية إلى كل بئر من نظام زجاج الغطاء ذو الثماني غرف جيدة في المختبر. ضع نظام انزلاق الغرفة على المنصة فوق الهدف.

ثم قم بإحضار الخرزات الممتصة إلى الزجاج للتركيز على المعاينة الحية. الجزء الأيسر هو القناة التي ستكون فيها الخلايا المنقولة GFP مرئية. سيعرض الجزء الأيمن TCR المسمى أثناء تجارب تصوير الخلايا الحية.

باستخدام محاذاة Y لإطلاق الألياف XY و Z ، اضبط موضع شعاع الليزر بحيث يخرج الشعاع من الهدف ويتم إسقاطه على السقف. من المهم القيام بذلك عندما يكون الهدف في الموضع الذي يكون فيه المستوى الزجاجي في بؤرة التركيز. إذا تم نشر الحزمة الموجودة على السقف ، فلن يتم تجميع الشعاع.

اضبط ميكرومتر Z لتحقيق ترتيب اختبار الترتيب الكامل لكل خط من خطوط الليزر التي سيتم استخدامها في التجربة. ثم باستخدام مقياس طاقة الليزر ، اضبط طاقة الليزر على 20 إلى 30 ميكرو واط لكل قناة. الخلايا التائية حساسة للغاية لإشعاع الليزر وتقتصر الإضاءة على إجمالي 50 ميكرو واط.

بجانب ضبط زاوية العشب. أدر ميكرومتر المحاذاة Y على إطلاق الألياف لتحريك الشعاع بعيدا عن السقف حتى زاويته. فيما يتعلق بالأهداف ، يقترب المحور البصري من 90 درجة.

بمجرد الوصول إلى الزاوية الحرجة للانعكاس الداخلي الكلي ، لن يخرج ضوء الليزر من الهدف لتقييم ما إذا كان قد تم تحقيق محاذاة العشب ، ركز لأعلى ولأسفل من خلال مستوى زجاج الغطاء. لاحظ هنا أنه عندما تمتص الخرزات على السطح يتم إخراجها من التركيز ، يمكن رؤية العديد من الخرزات تطفو في المحلول. لتحقيق محاذاة جيدة للعشب ، من الضروري زيادة زاوية الشعاع فيما يتعلق بالهدف.

مع زيادة زاوية الحزمة ، تبدأ الخرزات التي تطفو بالقرب من السطح في الاختفاء وتزداد كثافة الخرزات الممتصة عند الواجهة. الآن ، عندما يتم إخراج الخرزات المضافة إلى الواجهة من التركيز ، لا تبقى أي حبات تطفو في المحلول مرئية. في هذه المرحلة ، يتم محاذاة العشب بشكل صحيح حيث يمكن فقط للحبات التي يتم امتصاصها في زلة الغطاء أن تكون فيها. ركز.

بعد ذلك ، لمحاذاة قنوات الفلورسنت الحمراء والخضراء فيما يتعلق ببعضها البعض ، ركز على الخرز وقارن موضع الميزات التي يمكن تحديدها في الصور المنتجة في كلتا القناتين. باستخدام مسامير الميكرومتر X و Y على حامل كاميرا واحد ، اجعل الموضع النسبي للخرز على مقربة قدر الإمكان. هنا. لاحظ الخرزة الساطعة في الربع الأيسر السفلي من كلتا الصورتين لضمان المحاذاة المكانية بين القناتين.

يتم إحضار هذه الميزة إلى نفس الموضع النسبي في كلتا الصورتين. التقط الصورة واحفظها من كلتا القناتين. سيتم استخدام هذه الصور كمعيار للتوطين لمواءمة القناتين.

يظهر مثال على هذه المحاذاة هنا قبل المحاذاة. يتم تدوير إحدى القنوات فيما يتعلق بالأخرى كما هو موضح في هذه الصورة حيث يتم تركيب الصور من قناتين حبات الدقة الفرعية. بعد التعديلات ، تتم محاذاة الصور كما هو موضح هنا.

يمكن فحص جودة المحاذاة بشكل أكبر من خلال مقارنة صور الخلايا الحية المنقولة ب GFP. لاحظ كيف يتم محاذاة منصة ليلى من القناتين بشكل مثالي. بعد محاذاة الصورتين باستخدام المعايرة التي تم إنشاؤها باستخدام الميكروبيدات الفلورية.

بمجرد إعداد المجهر ، يتم تحضير غرف التدفق التي تحتوي على طبقات ثنائية دهنية مدعومة بالزجاج تقدم مستضد ويتم إجراء العشب M لتصور الخلايا التائية المنقولة التي تتفاعل مع الركيزة أولا. باتباع البروتوكول الذي وصفته آنا وداستن ، قم بتجميع غرفة تدفق ذات طبقات دهنية مستوية تشكلت على زلة غطاء زجاجي تحتوي على دهون NI NTA ، وجزيء الالتصاق ICAM واحد ومجمعات معقد التوافق النسيجي النسيجي النسيجي الكبير الببتيد. يتم دمج IEFK المحملة ب MCC في الطبقة الثنائية عبر علامات الهيستيدين.

دمج جزيء التحفيز المشترك CD 80. باستخدام مرساة GPI ، ضع خلية التدفق على مسرح المجهر وقم بتثبيتها عن طريق ربط الغرفة بلوحة محول على مرحلة المجهر باستخدام شريط شد لشل حركتها. بعد ذلك ، قم بتوصيل عنصر التسخين المزود بالشركة المصنعة على خلية التدفق للتحكم في درجة حرارتها.

ضع الهدف على طبقة ثنائية وقم بتركيز المستوى ثنائي الطبقة لتمكين تسخين الهدف ومفتاح خلية التدفق على خلية التدفق والسخانات الموضوعية لرفع درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية. بعد أربع ساعات من الحضانة ، انقل الخلايا التائية المنقولة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي بسرعة 80 مرة G.أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت H-B-S-B-S-A. ثم أضف H 57 FAB أو H 57 جزء متغير أحادي السلسلة لتسمية TCR بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر ل fab أو 20 ميكروغرام لكل مليلتر للجزء المتغير أحادي السلسلة.

انقل الخلايا إلى أنبوب فاكس سعة خمسة ملليلتر. بعد ذلك ، باستخدام حقنة طرف انزلاقية سعة مليلتر واحد ، قم بحقن الخلايا في غرفة التدفق عبر صمام ثلاثي الاتجاهات. قم بإعداد شروط التصوير بحيث يعرض الاكتساب المباشر ثنائي القناة معاينة مباشرة لقنوات TCR و GFP والعثور على حقل به خلايا منقولة.

نظرا لاختلافات الشدة بين TCR و GFP ، قد يتعين ضبط مقياس الصور في الوقت الفعلي بحيث يمكن تصور الخلايا في كلتا القناتين. كما هو الحال هنا ، قم بتأكيد إضاءة العشب عن طريق تركيز المستوى الزجاجي لأعلى لاكتشاف أي تلطيخ غشاء جانبي. إذا لم يتم التركيز على الأغشية الجانبية ، فإن محاذاة العشب جيدة.

في هذه المعاينة الحية ، يظهر تلطيخ الغشاء الجانبي في كل من مستوى انزلاق الغطاء وعندما يتم إخراج زلة الغطاء من التركيز لجلب المجهر إلى محاذاة العشب الجيدة. تزداد زاوية الليزر بالنسبة للهدف ويخرج الغشاء الجانبي عن التركيز. ابدأ في التقاط الصور الفردية وتسلسلات الفاصل الزمني بفاصل زمني قدره 10 ثوان.

لمدة خمس دقائق ، تم تحضين الخلايا على زجاج مدعوم وطبقات ثنائية INTA تحتوي على ستة جزيئات لكل مربع. ميكرومتر من الببتيد المحمل hist الموسوم ب IEFK 100 جزيء لكل ميكرومتر مربع من Alexa 6 4 7 hist المترافق الموسوم ICAM واحد و 100 جزيء لكل مربع. تم إجراء ميكرومتر من الفحص المجهري للعشب الاستحواذي المتزامن على القناة المزدوجة GPI في الوجود المستمر ل Alexa 5 46 المترافق H خمسة سبعة أجزاء FAB.

لتلطيخ خلايا TCR تم تصويرها لمدة تصل إلى ساعة واحدة بعد التلامس الأولي مع الطبقة الثنائية. تم تحليل عدد مجموعات ZAP 70 لكل خلية باستخدام برنامج آلي لعد المجموعات. تم تحليل ما لا يقل عن 40 خلية في كل حالة.

يشار إلى الببتيدات التي تم تحميلها في الداخل. يشير ICAM واحد إلى الخلايا على الطبقات الثنائية التي تحتوي على 100 جزيئات لكل ميكرومتر مربع من Alexa 6 4 7 مترافقة. تحدث إشارات ICAM الموسومة الخاصة به كما هو موضح في الشكل zap 70 في مجموعات TCR الدقيقة وفقط استجابة للروابط الناهضة كما يمكن رؤيته في هذا الفيلم ، الذي تم التقاطه في 10 ثوان لكل إطار.

يتم الحفاظ على إشارات TCR استجابة للببتيدات الناهضة من خلال التوليد المستمر لمجموعات TCR الدقيقة في محيط منطقة التلامس التي تجند ZAP 70. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل الخلايا التائية الأولية باستخدام تقنية المودة النووية maxa وتصوير تجنيد جزيئات إشارات GFPT بشكل صحيح في مجموعات TCR الدقيقة باستخدام المجهر العشبي. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفا جدا مع خلاياك الأولية. كلما كانت الخلايا سليمة في كل خطوة من خطوات التجربة ، زادت كفاءة التعداء وزاد عدد الخلايا التي ستلتقطها في التصوير. الخلايا التائية عالية الارتفاع ، ونتيجة لذلك ، يتسبب التصوير المتسلسل لقناة TCR و GFP في عدم محاذاة الصورتين تماما بسبب حركة المجموعات والخلايا الدقيقة TCR.

للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير مجهر العشب المتزامن ثنائي القناة.