A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج ناقل A ، b ، C. في هذه الحالة ، يتحول ناقل المالتوز إلى جزيئات قرص نانو غشائية قابلة للذوبان. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط بروتين السقالة الغشائية MSP أولا ، مع الناقل والكمية الصحيحة من الدهون في خلايا المنظفات.

الخطوة الثانية هي إضافة حبات البوليسترين وهز الخليط برفق طوال الليل ، يتم امتصاص المنظف تدريجيا على الخرز ، مما يسمح بتكوين جزيئات قرص النانو. بعد ذلك ، تتم إزالة الخرزات عن طريق الترسيب. الخطوة الأخيرة هي فصل الأقراص المشكلة بشكل صحيح عن الركام وبروتينات السقالة غير المجمعة عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الهلام.

أخيرا ، يتم تقييم جودة الأقراص عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي أو التحليل الطيفي لتشتت الضوء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل الجسيمات الشحمية ، هي أن بروتينات الغشاء والأقراص قابلة للذوبان تماما في المحلول المائي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الآن الوصول إلى مجالات البروتين من كلا الجانبين.

نظرا لأنه لم يعد هناك الآن حجرة غشاء باستخدام بروتينات سقالة الغشاء بأطوال مختلفة ، تمكنت من حبس ودراسة حالات الأربطة المختلفة لبروتينات الغشاء. الأهم من ذلك ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البروتيني الغشائي ، مثل تحديد شركاء الربط الجدد لناقلات a و b و C. في الواقع ، تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج لأنها يمكن أن تساعد في اكتشاف منشطات أو مثبطات بروتينات ومستقبلات الغشاء.

على الرغم من أن هذه الطريقة تبدو بسيطة ، إلا أنه يجب توخي الحذر عند اختيار نسبة دهون البروتين الصحيحة. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في حساب نسبة القالب الصحيحة أو القيام بالتحكم الصحيح الذي يضمن جودة التحضير. لذلك ، يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا جدا للطالب الجديد لتعلم الخطوات المختلفة والصعوبات المحتملة.

لبدء gro hexa histidine الموسومة MSP في سلالة القولونية الإلكترونية BL 21 DE ثلاثة من البلازميد P MSSP 1D إنتاج البروتين المستحث عندما تكون الكثافة البصرية المقاسة عند 600 نانومتر حوالي 0.5 لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية ، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في TSG 10 المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 ميكرومولار من قمل PMSF الخلايا بضغطة فرنسية ثلاث مرات عند 8,000 PS. أقوم بإزالة المادة غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 جي ثانية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اعزل الجزء القابل للذوبان الذي يحتوي على MSP عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 125،000 Gs لمدة 45 دقيقة.

قم بتنقية MSP عن طريق كروماتوغرافيا مخلب النيكل باستخدام ما يقرب من 1.5 مل من مصل النيكل عالي الأداء في المخزن المؤقت TSG 10. اغسل الملوثات باستخدام المخزن المؤقت T SG 10 الذي يحتوي على 50 مللي مولار ILE elute. MSP مع TSG 10 مخزن مؤقت يحتوي على 600 مللي مولار I midaz بعد غسيل الكلى.

يمكن تخزين البروتين المنقى في TSG 10 buffer MSP عند 70 درجة مئوية تحت الصفر وتركيز بروتين يبلغ حوالي 10 إلى 15 ملليغرام لكل مليلتر. يتم التعبير عن مركب MALF GK two ، الذي تم وضع علامة عليه عند الطرف C من MAL K ، من البلازميد. PED 22 FG K يزرع في سلالة الإشريكية القولونية BL 21 DE ثلاثة تحفز إنتاج البروتين عندما تكون الكثافة الضوئية المقاسة عند 600 نانومتر حوالي 0.5 مع 0.2٪ لتر من العرب لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي.

كما كان من قبل, نقوم بتعليق الحبيبات الغشائية في TSG 20 المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي قدره خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإذابة المادة بوزن 1٪ لكل حجم GDM لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف. قم بإزالة المواد غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي الفائق كما هو الحال بالنسبة لتنقية MAL FTK two.

ثم اجمع المادة الطافية التي تحتوي على مركب FTK القابل للذوبان وتنقيته مرة أخرى باستخدام كروماتوغرافيا مخلب النيكل. قم بتنقية المركب بشكل أكبر عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الهلام في المخزن المؤقت TSGD على عمود SUEx 200 ، HR عشرة ثلاثمائة عمود بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة. لتحضير الدهون الفوسفورية ، يتم فصل مستخلص الدهون الكلي الإشريكية القولونية المذاب في الكلوروفورم إلى 1000 حصة شاذة في أنابيب ميكروفيش ذات غطاء لولبي تتبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين وتدفع أكثر بين عشية وضحاها في الفراغ.

جفف بعد ذلك ، قم بإذابة الفيلم الدهني في المخزن المؤقت TS بتركيز نهائي خمسة NMO ودوامة بقوة ثم نبض صوتنة خمس مرات لمدة خمس ثوان تقريبا. ستظهر الدهون الذائبة معتمة قليلا بسبب عدم قابليتها للذوبان العام في المخزن المؤقت المائي TS ، ولكن يجب أن تظل معلقة. أضف DDM إلى التركيز النهائي بنسبة 0.5٪ في هذه المرحلة ، سيصبح المحلول واضحا ، ضع خليط الدهون في حمام مائي ونبض الصوتنة خمس مرات لمدة خمس ثوان تقريبا.

يمكن تخزين خليط الدهون عند أربع درجات مئوية لمدة أسبوع واحد كحد أقصى. لتحضير الخرزات الحيوية ، ضع ما يقرب من 10 إلى 15 مل من الخرزات الحيوية في أنبوب سعة 50 مل. أولا ، اغسل الخرزات ب 50 مل من الميثانول بنسبة 100٪.

اسمح للحبات بالاستقرار عن طريق الجاذبية ثم اسكب المحلول برفق. كرر العملية مرة واحدة للميثانول ثم مرتين لكل منهما 95٪ من الإيثانول مللي Q وأخيرا المخزن المؤقت TS. ابدأ التكوين النانوي المنفصل عن طريق تخفيف MSP في المخزن المؤقت TSGD إلى التركيز النهائي البالغ حوالي سبعة ملليغرام لكل مليلتر أو 0.3 ملليمول.

لضمان تجربة ناجحة ، من المهم اختيار النسب الصحيحة للدهون والبروتينات ليتم خلطها معا. امزج ما يقرب من اثنين M من malf المنقى GK اثنين من المركب في بروتين إلى MS P إلى نسبة الدهون من واحد إلى ثلاثة إلى 60 في المخزن المؤقت TSGD للحصول على حجم نهائي يبلغ 300 ميكرولتر هنا ، يتم أيضا تحضير عينة من الدهون الزائدة بنسبة واحد إلى ثلاثة إلى 400 كعنصر تحكم سلبي عند 50 ميكرولتر من تعليق الخرزة الحيوية إلى الأنبوب واحتضان الخليط طوال الليل على أ طاولة هزاز عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي ، ترسيب الخرزات بالجاذبية. بمجرد أن تستقر الخرزات في الأنبوب في المحلول من خلال طرف ضيق لتجنب أكبر قدر ممكن من الخرز الحيوي.

قم بإزالة الرواسب الكبيرة عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100 ، 000 GS لمدة 20 دقيقة. استمر في تنقية الأقراص عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الهلام كما تم إجراؤه سابقا في المخزن المؤقت TSG 10. بعد ذلك ، قم بحقن Eloqua على نفس عمود ترشيح الهلام لاختبار استقرار المستحضر.

ثم قم بتجميع الكسور التي تحتوي على الأقراص. يتم تقييم جودة المستحضر عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي. قم بتحليل ميكرومولار واحد من أقراص النانو لتقييم جودة إعادة التكوين.

قم أيضا بتقييم ارتباط mal E ب mal ftk اثنين من المركبين المعاد تشكيلهما في أقراص النانو. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتلطيخ الجل باللون الأزرق كوماسي لمدة 10 دقائق واحتجز لمدة ساعة تقريبا. لإجراء تشتت الضوء الديناميكي أو DLS ، قم أولا بتنقية أقراص النانو عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الهلام كما كان من قبل ، باستخدام عمود SUEx 200 HR وعشرمائة وثلاثمائة بمعدل تدفق يبلغ 0.1 مل في الدقيقة.

كسور تجمع تحتوي على أقراص نانو ، وتركز إلى ما يقرب من 10 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام مرشح طرد مركزي AmCon. ثم قم بتصفية العينة مرتين. قم بإجراء التحليل بواسطة DLS باستخدام أداة dynapro nano star في بيانات كوارتز صغيرة الحجم داخلية بميكرولتر واحد.

باستخدام البرنامج الديناميكي لتقدير القطر والوزن الجزيئي للجسيمات ، حدد نشاط A TPAs ل mal FTK اثنين من أقراص النانو المعاد تشكيلها باستخدام اختبار متري الكول. أولا ، امزج ميكرومولار واحدا من الأقراص المنقاة ومليمولار واحد TP مع كميات متزايدة من mal e. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم قم بقياس إطلاق الفوسفات غير العضوي عند 660 نانومتر. قارن كمية الفوسفات المنبعثة بمنحنى قياسي متولد بمحلول قياسي للفوسفور. يتم تنقية أقراص النانو عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الجل.

يوضح الكروماتوجرام أن غالبية الأقراص المعاد تشكيلها تتخلص من ذروة واحدة ، في حين أن الأقراص المصنوعة من الدهون الزائدة تتخلص من حجم الفراغ ، وكسلسلة من القمم العريضة ، يتم تحليل جودة تحضير القرص بشكل أكبر بواسطة أقراص الرحلان الكهربائي الهلامية الأصلية المعاد تشكيلها بكمية محدودة من الدهون تهاجر كشريط حاد على الهلام الأصلي ، في حين أن تلك التي أعيد تشكيلها في وجود فائض من الدهون تهاجر على شكل لطاخات. يظهر التحليل الذي أجرته DLS أن عدد الأقراص متجانس بمتوسط نصف قطره 5.0 نانومتر. بناء على تقريب DLS ، فإن الأقراص المعاد تشكيلها لها وزن جزيئي ظاهري يبلغ 215 كيلوڈالتون ، وتظهر العينات المعاد تشكيلها في وجود الدهون الزائدة أنصاف أقطار موزعة على نطاق واسع حوالي 100 نانومتر ، وهو أمر نموذجي للعينات غير المتجانسة.

يتم تقييم نشاط مركب MAL FTK 2 من خلال قياس معدل التحلل المائي TP والتقارب مع الشركاء المتفاعلين مثل بروتين ربط المالتوز ، MAL E ، بروتين ربط المالتوز. يرتبط MAL E بتقارب عال مع ناقل FTK ثنائي MAL باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام غير المتغير. من الممكن اكتشاف مركب بين MAL E و MAL ftk two ، يظهر هنا تحفيز نشاط MAL KA TPA بواسطة MAL E كدالة لتركيز MAL e.

يعد صنع قرص النانو بسيطا نسبيا ، ومع ذلك فإن الانحرافات الصغيرة عن الظروف المثلى يمكن أن تؤدي إلى تراكم البروتين الذي لا رجعة فيه بمجرد إتقانه ، ويمكن إجراء هذه التقنية في أقل من يومين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أهمية اختيار نسبة الدهون البروتينية الصحيحة لأن الكمية الزائدة من الدهون ستؤدي إلى إنتاج جسيمات شحمية كبيرة مثل الجسيمات. من الأهمية بمكان تحليل جودة المواد المعاد تكوينها بعناية باستخدام تقنيات أخرى غير ترشيح الهلام ، مثل التحليل الطيفي لتشتت الضوء ، أو الطرد المركزي التحليلي ، أو ببساطة الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي.

تذكر أن نوع الدهون الفوسفورية التي تشتمل على القرص وكذلك بروتين السقالة الغشائية يمكن أن تساهم في كفاءة إعادة التكوين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن تكون قد حصلت على فهم جيد لكيفية توليد أقراص نانوية قابلة للذوبان ومتجانسة تحتوي على بروتين الغشاء الذي تختاره. حظا سعيدا في تجاربك.